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。2010年12月1日；49(11):1674-84.
doi:10.1016/j.freeradbiomed.2010.08.028。 Epub 2010年9月7日。

线粒体靶向药物对帕金森病模型的神经保护作用

阿纳米特拉·戈什 1, 卡鲁纳卡兰·钱德兰, Shasi V Kalivendi公司, 乔伊·约瑟夫, 威廉·安托里尼, 塞西莉亚·J·希拉德, 阿尔蒂·坎塔萨米, 阿努曼塔·坎塔萨米, 巴拉拉曼·卡利亚纳拉曼
附属公司

线粒体靶向药物对帕金森病模型的神经保护作用

阿纳米特拉·戈什等。 自由基生物医学。 。

摘要

本研究的目的是在帕金森病（PD）实验模型中评估线粒体靶向抗氧化剂Mito-Q（10）的神经保护作用，Mito-Q10是一种辅酶-Q类似物，与靶向线粒体抗氧化剂的三苯基膦阳离子相连。用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）神经毒素的活性代谢产物1-甲基-4-苯基吡啶（MPP（+））处理原代中脑神经元细胞和培养的多巴胺能细胞，并用小鼠测试Mito-Q（10）的疗效。MPP（+）治疗导致多巴胺能细胞中酪氨酸羟化酶和膜电位的剂量依赖性丢失，caspase-3激活增加，这被Mito-Q（10）逆转。MPTP治疗导致小鼠纹状体多巴胺及其代谢物丢失，黑质线粒体乌头酸酶失活，运动活动丧失。在细胞培养和小鼠模型中，使用Mito-Q（10）显著抑制MPP（+）和MPTP诱导的神经毒性。总之，这些结果表明，在这种临床前PD小鼠模型中，线粒体靶向抗氧化剂是一种很有前景的神经保护策略。

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数字

图1
图1
MPP对大鼠MDN酪氨酸羟化酶蛋白的抑制作用+（A）用不同浓度的MPP处理MDN+48小时后，使用针对TH和β-肌动蛋白的单克隆抗体，然后结合辣根过氧化物酶的二级抗体，通过Western blotting测定TH水平。ECL检测系统可显示色带。使用Alpha Imager软件通过密度分析计算谱带强度，并将对照组的TH/β-肌动蛋白比率标准化为100%。（B） 在与（A）类似的治疗条件下，通过免疫细胞化学观察培养物中多巴胺神经元的存活情况，使用针对TH的多克隆抗体和与FITC偶联的二级抗体。使用配备有Metamorph软件的尼康荧光显微镜获得荧光图像。从20个视野中统计具有完整轴突的存活神经元的数量，并将对照组获得的神经元总数标准化为100%。（C） （B）中所示数据的密度分析。（D） 如（B）所述，通过免疫组织化学观察多巴胺神经元的存活情况。多发性脑脊髓炎接受多发性脑脊髓炎治疗+、MPP+和Mito-Q10和Mito-Q10所示数据为三个单独实验的平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比<0.01。
图2
图2
Mito-Q公司10抑制MPP+-诱导线粒体膜电位丢失。（A） N27细胞与MPP孵育+在Mito-Q在场和缺席的情况下1048 h。用JC-1（3μl/ml）处理细胞30 min，用PBS洗涤两次，并覆盖在FITC和罗丹明滤光器设置下获得的荧光图像。（B） 通过使用Metamorph软件测量尼康荧光显微镜中590 nm（橙色）和530 nm（绿色）荧光发射之间的比率，量化显示聚集与单体JC-1探针的细胞数量，并将在控制条件下获得的值标准化为1。所示数据为三个单独实验的平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）与对照组相比<0.01#P（P）与MPP相比<0.05+-治疗组。
图3
图3
Mito-Q的保护作用10MPP上+-大鼠N27细胞模型的诱导毒性。（A） 用150μM MPP处理N27细胞+在Mito-Q在场和缺席的情况下10使用Sytox染料测量细胞毒性。（B） （A）中所示数据的密度测定结果。（C） 培养结束后，使用底物DEVD-AFC测量细胞裂解液中caspase-3样活性，如材料和方法所述。（D） 与（B）相同，不同之处在于Mito-Q的作用10与Co-Q的数据进行了比较。显示的数据是四个单独实验的平均值±SD*P（P）<0.01和**P（P）<0.001, ***P（P）与对照组相比<0.0001#P（P）与MPP相比<0.001+-治疗组。
图4
图4
Mito-Q预处理10恢复MPP中的多巴胺水平+-处理过的神经元细胞。（A） 用不同浓度的MPP处理MDN+培养结束后，用DPBS清洗细胞三次，并在200μl 0.1 M高氯酸中溶解。按照材料和方法中的描述，使用带安培-库仑阵列检测的HPLC方法、C18反相柱和TM-50溶剂（流速，0.6 ml/min）从50μl澄清上清液等分中测定多巴胺水平。多巴胺水平归一化为总蛋白，并使用多巴胺标准计算值。（B） 用MPP治疗MDN后测定多巴胺水平+（25μM），MPP+加上Mito-Q10和Mito Q.显示的数据是三个单独实验的平均值±SD**P（P）与对照组相比<0.01#P（P）与MPP相比<0.01+-治疗组。
图5
图5
Mito-Q的作用10亚急性MPTP处理小鼠纹状体多巴胺和多巴胺衍生代谢物。给小鼠注射Mito-Q10（4 mg/kg）经口灌胃1天（MPTP前的预处理）、5天（与MPTP共同处理）和7天（MPTP后的处理）。每天腹腔注射MPTP（25 mg/kg/天），持续5天，从第2天开始，到第7天结束。对照组小鼠接受相同剂量的生理盐水。在最后一次注射MPTP七天后，处死小鼠，用HPLC从纹状体测量（A）多巴胺、（B）DOPAC和（C）HVA。数据为每组6只小鼠的平均值+扫描电镜*P（P）与对照组相比，<0.001**P（P）与MPTP相比，<0.001#P（P）与MPTP相比<0.05@P（P）与MPTP相比<0.01。
图6
图6
Mito-Q的作用10在亚急性MPTP处理小鼠的黑质纹状体上。给小鼠注射Mito-Q10（4 mg/kg剂量）经口灌胃1天（给药前的预处理）、5天（与MPTP联合治疗）和7天（MPTP后的治疗）。从第2天开始，每天单剂量腹腔注射MPTP（20 mg/kg），持续5天。对照组小鼠接受相同剂量的生理盐水。MPTP治疗7天后灌流小鼠，在（A）纹状体（2倍原始放大倍数）、（B）黑质（2倍初始放大倍数）和（C）黑质中进行TH-DAB免疫染色。（D） 黑质TH阳性神经元的体视学计数。数据为每组5或6只小鼠的平均值±SEM*P（P）与对照组相比<0.01**P（P）与MPTP相比<0.05。
图7
图7
Mito-Q的作用10MPTP诱导的运动障碍。给小鼠注射Mito-Q10（4 mg/kg剂量）经口灌胃1天（给药前的预处理）、5天（与MPTP联合治疗）和7天（MPTP后的治疗）。从第2天开始，每天一次性腹腔注射MPTP（25 mg/kg），持续5天。对照组小鼠接受相同剂量的生理盐水。在最后一次注射MPTP后5天，使用VersaMax分析仪和旋转仪测量运动活动。（A） 鼠标移动轨迹（VersaPlot）；（B） 水平活动；（C） 垂直活动；（D） 总行驶距离（cm）；（E） 总移动时间（s）；（F） 总休息时间；（G） 饲养活动；（H） 转速为20 rpm时，在旋翼机上花费的时间。数据为每组8只小鼠的平均值+扫描电镜*P（P）<0.001与对照组相比**P（P）与MPTP相比<0.05#P（P）与对照组相比<0.01@P（P）与对照组相比<0.05。
图8
图8
小鼠脑组织的低温EPR谱。（A） 从MPTP-和MPTP+Mito-Q分离的纹状体组织中获得了10–15 K的EPR谱10-治疗小鼠。（B） 与（A）相同，只是组织是从小鼠黑质中分离出来的。（C） 方框内区域的展开如（A）所示。（D） 方框内区域的展开如（B）所示。（E） 真实[3Fe–4 S]的EPR谱+由细胞溶质和线粒体乌头糖生成。为了进行比较，该区域的扩展频谱克=2.01–2.03来自MPTP处理小鼠分离的SN组织。（F） 显示在克=2.01–2.03来自于使用MPTP和MPTP加Mito-Q治疗的小鼠大脑不同区域的组织10。在10 K下记录光谱。
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