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.2010年11月5日；285(45):35079-91.
doi:10.1074/jbc。M109.098160。 Epub 2010年8月31日。

半乳糖凝集素-3特异性和生物学功能的突变调控

艾玛·萨洛蒙森 1, 迈克尔·卡尔森, 维罗妮卡·奥斯拉, 鲁斯·亨德斯·阿尔滕伯格, Barbro Kahl-Knutson公司, 克里斯托弗·托伯格, 安德斯·桑丁, 里卡德·尼尔森, 伊娃·诺德伯格-卡尔森, Ulf J Nilsson公司, 安娜·卡尔森, 詹姆斯·里尼, 哈肯·莱夫勒
附属公司

半乳糖凝集素-3特异性和生物学功能的突变调节

艾玛·萨洛蒙森等。 生物化学杂志. .

摘要

半乳糖凝集素是由一个保守的β-半乳糖苷结合位点定义的，该位点与半乳糖在细胞粘附、信号传递和细胞内贩运等方面的许多重要功能有关。弱邻近位点可能增强或降低对天然β-半乳糖苷糖复合物的亲和力，但对这种亲和力调节的生物学作用知之甚少（精细特异性）。我们现在已经产生了10个人类半乳糖凝集素-3突变体，这些相邻位点的变化改变了碳水化合物结合的精细特异性，但保留了糖阵列结合和基于溶液的荧光各向异性分析所显示的基本β-半乳糖苷结合活性。每个突变体还通过两种生物检测进行测试，以提供精细特异性和功能之间的相关性。半乳糖凝集素-3 R186S选择性地失去了对LacNAc（一种常见于糖蛋白聚糖上的双糖部分）的亲和力，失去了激活中性粒细胞和细胞内靶向小泡的能力。K176L增加了与GlcNAcβ1-3取代的β-半乳糖苷的亲和力，正如在多聚N-乙酰基乳糖氨基多糖中发现的那样，并且提高了激活中性粒细胞的效力，尽管它已经失去了半乳糖凝集素-3的其他方面的精细特异性。G182A改变了碳水化合物结合的精细特异性，并改变了细胞内对囊泡的靶向性，这可能与该突变丢失的细胞内半乳糖凝集素3介导的抗凋亡作用有关。最后，突变体有助于确定爪蟾、小鼠和人类半乳糖凝集素-3在精细特异性方面的差异，以及进化过程中适应性变化的证据。

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数字

图1。
图1。
半乳糖凝集素-3 CRD与糖配体的复合物。 一，半乳糖凝集素-CRD显示为一个溶剂可及表面，结合LacNAc为基于x射线晶体结构的棒状模型（PDB代码1KJL）（38）。显示了站点A-D的位置装订槽上方和松散定义的站点E正确的。构成C位点的六个保守氨基酸如所示白色（带有黑色文本Trp-181）和周围的突变残基（Arg-144、Ala-146、Lys-176、Asn-180、Gly-182、Arg-186）黑底白字; Asp-148标记为参考，但没有突变。LacNAc的Gal残留如所示黑色标有位置3，GlcNAc如所示白色标有位置1。b条和c（c），所示为带有结合LacNAc（PDB代码1KJL）的核心碳水化合物识别位点（C-D）的特写(b条)或Galβ1–3GlcNAc模型(c（c）). 这个白色数字指出与保守结合位点发生相互作用的位置，以及取代会阻碍结合的位置。其他标签与面板a注意还原羟基在b–c(标记为1)，这将以不同的方式指导此处链接的结构。这些图像由PyMOL（DeLano Scientific LLC，加利福尼亚州帕洛阿尔托）制作。
图2。
图2。
野生型半乳糖凝集素-3及其突变体的糖基阵列分析。每个图都显示了绑定（如细钢筋)将荧光标记的半乳糖凝集素（野生型或突变型，最终浓度200μg/ml）添加到179个潜在半乳糖结合聚糖中的每一个，表示为RFU×10−4在年轴。结合数据显示了两次，其中聚糖由可能位于半乳糖凝集素C-D位点的二糖分组(面板a)或可能位于B位点的单糖，即与C位半乳糖的3位相关(面板b). 在这两个面板中，聚糖是根据其与野生型半乳糖凝集素-3（来自左边到正确的). 聚糖的分组特征如下所示x个轴使用功能糖组学联盟推荐的符号。对于站点C-D，它们来自左边到正确的，Galβ1–4GlcNAc，Galβ1–3GlcNAc，Galβ1–4Glc，Galβ1–3GalNAc和其他。对于站点B，它们是硫酸盐-3、NeuAcα2-3、GalNAcα1-3、Galα1-3、GlcNAcβ1-3，什么都没有（即站点C中的Gal是终端）。这个右下角示意图属于面板a显示野生型半乳糖凝集素-3和所有突变体与阵列上其余227个聚糖的背景结合非常低，因为它们不含β-半乳糖，或者它们所含的所有含β-半乳糖苷的二糖都被取代位阻C和D（2）部位的结合而被阻断，如图1所示，b条和c（c）R186I突变体比其他突变体具有更高的背景（五个峰>1000 RFU，最大2674），但不足以混淆解释。结合、聚糖结构和原始聚糖编号的数值见补充表S2、a和b.
图3。
图3。
野生型半乳糖凝集素-3及其突变体的荧光各向异性分析。每个面板显示一个条形图相对亲和力((K（K）一突变体）/(K（K）一半乳糖凝集素-3重量）=(K（K）d日半乳糖凝集素-3重量/K（K）d日突变）1个突变，用于15种不同的荧光标记糖探针（1-15）。相对亲和力的平均值基于在冷冻条件下（～4°C）使用荧光各向异性分析进行的分析，n个≥4，详见补充图S2和表S3糖类探针如图下方的表格双糖最有可能在C-D位点结合，如大胆的.
图4。
图4。
站点B中的交互建模。连接到C位点Gal的3位的单糖和选定的氨基酸侧链如下所示棒状模型标记了一些位置和官能团，氢键表示为虚线galectin-3 CRD的透明表面显示为背景。一，显示了NeuAc在NeuAca2–3Galβ1–4Glc中的一个可能位置，基于NeuAcα2–3Lac与半乳糖凝集素-8的N-CRD的复合物（19）；在NeuAcα2–3Lac与真菌半乳糖凝集素（40）复合物的x射线晶体结构中发现了另一个类似的位置，尽管在这种情况下B位点的结构不同。b条图中显示了GlcNAcβ在乳糖-N-新四糖（Galβ1–4GlcNAcβ1–3Galβ1-4Glc）中的位置，以及半乳糖-N-新四糖与半乳糖-CRD复合物的x射线晶体结构中的氨基酸侧链。c（c）图中显示了GalNAcα在血型a四糖（GalNAcα1–3（Fucα1–2）Galβ1–4Glc）中的位置，该四糖基于与真菌半乳糖凝集素的复合物（39）。模型由MacroModel（9.7版）生成，图像由PyMOL生成。
图5。
图5。
亲和力的荧光各向异性分析爪蟾(左边)和鼠标(正确的)半乳糖凝集素-3与人半乳糖凝素-3的关系。进行了分析，结果如图3所示，如下所示条形图的相对亲和力爪蟾和小鼠galectin-3((K（K）一爪蟾或小鼠galectin-3）/(K（K）一人半乳糖凝集素-3重量））用于15种不同的荧光素标记的糖探针(1–15).每个图表下方是人体半乳糖凝集素-3的模型，如图1所示一但有颜色黑色针对不同动物半乳糖凝集素和白色对于那些相同的。标记位置B中不同的残留物。
图6。
图6。
野生型半乳糖凝集素-3和突变体激活TNFα引发的中性粒细胞的剂量反应。剂量(x个轴）响应(年轴）和突变体如所示灰色和黑色分别位于所有面板中。使用发光测定法测量活性氧物质的体外和细胞内释放。每个数据点是时间曲线的峰值（活性氧物种）响应（如补充图S3)，通过定义100%为最高浓度（3.5μ米)野生型galectin-3平行运行。n个= 3.
图7。
图7。
野生型半乳糖凝集素-3和突变体与未激发和TNFα激发的中性粒细胞的结合。FITC-标记的半乳糖凝集素与新制备的中性粒细胞孵育，中性粒细胞在37℃孵育30分钟(白条)或使用TNFα(灰色条)在4°C下，不含TNFα(黑色条)作为防止颗粒动员的对照。用流式细胞术测量结合半乳糖凝集素的量，并将其作为荧光强度几何平均值的平均值和S.E(年axis）对不同批次的中性粒细胞进行三次实验。这个第页值是根据成对单尾计算得出的t吨测验；配对，以降低中性粒细胞和单尾细胞之间的变异性，以专门测试与TNFα孵育后结合增加的假设。
图8。
图8。
GFP-半乳糖凝集素-3 wt和两个突变体在SKBR3乳腺癌细胞中的表达和定位。携带EGFP-galectin-3野生型基因的pEGFP-C1载体稳定转染人乳腺癌细胞株SKBR3(面板a)，EGFP-R186S(面板b)和EGFP-G182A(面板c)分别为。细胞培养在盖玻片上，固定在4%多聚甲醛中，用带有DAPI的Prolong防褪色试剂固定，并用荧光显微镜进行分析。含半乳糖凝集素的小泡数量（视为荧光点)每种情况下，每个细胞计数为300个细胞，表示为条形图在每个样品显微镜面板下。
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