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.2010年8月26日；67（4）：562-74。
doi:10.1016/j.neuron.2010.08.001。

靶向单个神经元网络用于体内基因表达和细胞标记

詹姆斯·马歇尔 1, 森喜昭（Takuma Mori）, 克里斯蒂娜·尼尔森, 爱德华·M·卡拉威
附属公司

靶向单个神经元网络用于体内基因表达和细胞标记

詹姆斯·马歇尔等。 神经元. .

摘要

为了了解单个哺乳动物神经元网络的精细结构和功能，我们开发并验证了一种策略，该策略在体内外以基因为靶点，追踪单个神经元的单突触输入。该策略独立地靶向神经元及其突触前网络进行特异性基因表达和精细标记，使用DNA的单细胞电穿孔来靶向遗传可改变的狂犬病病毒的感染和单突触逆行传播。该技术高度可靠，每一个感染病毒的电穿孔神经元都会出现跨突触体标记。针对体内单个新皮质神经元网络，我们发现除了复杂标记的远端皮层和皮层下输入外，在每种情况下，电穿孔神经元周围都有棘状和无棘状神经元簇。这项技术广泛适用于在体内以单细胞分辨率探测和操作单个神经元网络，可能有助于揭示整个大脑神经元网络电路发展和信息处理的基本机制。

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数字

图1
图1。单细胞追踪策略
（A） 用编码荧光标记物（例如pCAG-mCherry）、TVA受体（pCMMP-TVA800）和狂犬病糖蛋白（pHCMV-RabiesG）的质粒（彩色圆圈）电穿孔单个神经元。（B） 1–3天后，将SADΔG-XFP（EnvA）病毒应用于组织，只感染电穿孔神经元，因为没有其他细胞表达EnvA受体TVA（红色表示电穿孔标记表达；黑色符号TVA和狂犬病糖蛋白（G））。当病毒在宿主神经元中复制时，它表达狂犬病基因组中的XFP，标记神经元（C）中的绿色；黄色与电穿孔标记合并）。（C） 3-6天后，在经过突触感染（虚线箭头）和狂犬病病毒表达时间后，用多聚甲醛固定组织，并用荧光显微镜观察组织。该病毒仅通过突触体感染并标记到原始宿主神经元的单突触体、突触前输入（绿色），而不是二级连接（红色交叉），因为狂犬病糖蛋白（跨突触体传播所必需的）仅在电穿孔神经元中表达。示意图显示了图4中用于实验的时间轴和基因结构。
图2
图2。在大鼠皮层切片培养中追踪单个神经元的单突触输入
（A） 将21个神经元与编码静脉YFP、TVA和狂犬病糖蛋白的质粒逐一电穿孔。两天后，在切片上涂抹SADΔG-mCherry（EnvA）。再过六天后，将切片固定在多聚甲醛中。电穿孔转染后，13个神经元表达了静脉YFP（绿色或黄色），8个神经元证实电穿孔和狂犬病标记物（黄色）同时表达。大约1000个神经元被病毒跨突触体感染，并表达mCherry（红色）。（B） 放大（A）中的方框，显示13个转染神经元中有5个（绿色或黄色）被密集的表达mCherry的神经元簇包围（红色）。这五个神经元中的四个也显示出mCherry表达（黄色）。一个神经元（白色箭头，绿色）显示venusYFP低表达，而没有显示mCherry表达。（C） 另一个切片中，只有一个神经元（黄色）与编码静脉YFP、TVA和狂犬病糖蛋白的质粒电穿孔。两天后，将SADΔG-mCherry（EnvA）直接涂在切片上。再过四天，将切片固定在多聚甲醛中。电穿孔神经元同时表达venusYFP（绿色）和mCherry（红色），表明成功转染和病毒感染（合并=黄色）。数十个神经元被病毒跨突触体感染，并表达mCherry，以红色显示（n=36；此处未显示的部分，参见补充图S1，图S1显示了更多跨突触标记的神经元以及同一电穿孔神经元的轴突标记范围）。比例尺：500μm in（A），50μm in。
图3
图3。在体内单细胞电穿孔的双光子成像可视化
（A） 细胞内溶液中含有Alexa染料和质粒DNA（绿色圆圈）的移液管的阴影成像示意图。施加在移液管背面的正压用荧光染料填充细胞外空间，但不填充神经元；它们在负片中显示为黑色阴影。（B）1)体内含有pCAG-YTB和Alexa染料的移液管在细胞内溶液中靠近神经元并使其膜凹陷的双光子荧光图像2). （B）三)电穿孔后，神经元立即充满Alexa 594染料（另见电影S1）。（C） 双光子显微镜下同一神经元的平均z投影体内五天后。由于电穿孔pCAG-YTB质粒中的静脉YFP的表达，神经元呈绿色。比例尺为15μm in（B1)，（B）2)、和（B三)（相同比例）和25μm in（C）。
图4
图4。追踪单个哺乳动物神经元的单突触输入在体内
（A） 使用图1所示的参数和试剂，针对小鼠视觉皮层中的单层2/3神经元（白色箭头指示的黄色神经元）进行单细胞追踪策略。电穿孔质粒的转染通过mCherry在神经元（inset）中的表达和SADΔG-EGFP（EnvA）对神经元的感染以及糖蛋白介导的狂犬病病毒向突触前神经元的跨突触传播得到证实，病毒在突触前神经细胞中表达EGFP。在（A）所示的电穿孔神经元周围发现了一簇不同类型的中间神经元和锥体细胞，并延伸到相邻的40μm截面上（例如（B），一些截面未显示）。在整个大脑中还发现了许多其他神经元，它们距离宿主神经元（C-G）几百微米到一厘米多。无论与宿主神经元的距离如何，神经元的形态学都被复杂地详细标记，并且可以基于形态学来表征标记神经元的细胞类型。在本实验中，共有97个神经元被病毒跨突触体标记。此图中的所有面板均来自同一动物。蓝色是神经元细胞核的NeuN染色。（B） 靠近（A）的中间部分。可以看到电穿孔神经元（黄色）的树突延伸到这一部分，以及神经元的下行轴突（用白色箭头表示）。（C） （A）中下白框所示的锥体神经元的高倍图像。该神经元位于宿主神经元尾部400μm以上，位于同一侧中层平面。神经元的详细形态清晰可见，神经元的树突棘和轴突完全充满。这张图片只显示了神经元过程精细化的一小部分。其中一些特征在（B，与（A）中的位置类似）中可见。（D） （A）中上部白框所示中间神经元的高倍图像。该神经元位于宿主神经元尾部200μm以上，位于同一侧中层平面。神经元树突树的完全填充使得神经元被描述为2/3层多极抑制神经元（在（B）中可以看到更多树突）。在这个实验中发现了数十个其他中间神经元，代表了多种细胞类型。（E） 在脾后皮质中，一个距离宿主神经元数百微米的投射神经元。（F） 下丘脑中经突触体标记的神经元。尽管与宿主神经元的距离超过1厘米，但该细胞中标记的亮度与整个大脑中标记的其他神经元相当。（G） 一个完全详细标记的视觉皮层投射神经元，位于宿主神经元侧面200μm以上。比例尺：100μm in（A），（B），25μm inset in（A，C）–（G）。
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