Deep sequencing of the small RNA transcriptome of normal and malignant human B cells identifies hundreds of novel microRNAs

doi:10.1182/blood-2010-05-285403

。2010年12月2日；116（23）：e118-27。

doi:10.1182/bloud-2010-05-285403。 Epub 2010年8月23日。

对正常和恶性人类B细胞的小RNA转录组进行深度测序，确定数百种新的microRNA

附属公司

PMID： 20733160
预防性维修识别码： PMC3012600
内政部： 10.1182/血液-2010-05-285403

对正常和恶性人类B细胞的小RNA转录组进行深度测序，确定数百种新的microRNA

德雷杰·D·吉马等。血液。 2010。

。2010年12月2日；116（23）：e118-27。

doi:10.1182/bloud-2010-05-285403。 Epub 2010年8月23日。

作者

附属

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学杜克基因组科学与政策研究所。

PMID： 20733160
预防性维修识别码： PMC3012600
内政部： 10.1182/血液-2010-05-285403

摘要

微RNA（miRNA）在迄今为止几乎所有被检测的生物系统中都有作用。在对其作用进行完整描述之前，必须先识别任何系统中存在的所有miRNAs。我们通过对31例包括B细胞分化谱和常见恶性表型的正常和恶性人类B细胞样本进行深度测序，阐明了正常和恶性B细胞的完整小RNA转录组。我们鉴定了333个已知miRNAs的表达，这是以前在任何组织类型中识别的数量的两倍多。我们进一步鉴定了286个候选新miRNAs在正常和恶性B细胞中的表达。使用定量聚合酶链反应对这些miRNA进行了高比率（92%）的验证，我们证明了它们在鉴别淋巴瘤临床相关亚群中的应用。我们进一步证明，一个新的miRNA簇，之前被注释为假设基因LOC100130622，包含6个调节转化生长因子-β途径的新miRNA。因此，我们的研究表明，目前大多数细胞类型中存在的三分之一以上的miRNA是未知的，这些miRNA可能调节重要的细胞功能。

PubMed免责声明

数字

图1
**识别正常和恶性B细胞中的miRNAs**（A）在B细胞中发现和验证已知和新的miRNA的分析管道。对来自B细胞亚群的小RNA进行大规模平行测序。原始序列读取（328 934 149）被过滤，映射到基因组，由miRDeep分析并注释。已识别的miRNA位点与miRBase13相互参照，以区分已知的和候选的新miRNA。（B）miR-20b的读取频率及其与基因组的比对。被矩形包围的序列对应于与基因组完美匹配的最丰富、最长的成熟miRNA序列。（C） RNAshapes程序的输出，该程序计算miRNA前体的抽象结构、预测结构的概率以及miR-20b前体结构的最小折叠自由能。（D） miR-20b前体的能量有利折叠，miRNA成熟序列和microRNA*序列以黄色突出显示。

图2
**小RNA在正常和恶性B细胞中的分布**（A）小RNA的表达，包括每个样本中的miRNA、tRNA、piRNA、snRNA、rRNA、snoRNA和tiRNA，显示出超过2倍的范围。样品的排列顺序与表1相同。（B）通过对幼稚、生发中心、记忆和血浆B细胞的两个生物复制品进行测序来测量miRNAs的表达。这个*P（P）*根据数据不相关的无效假设，使用相关性检验计算值；*P（P）*< 10⁻⁶在所有4例中。（C）实时PCR和测序检测到的miRNAs相对表达在幼稚到生发中心的B细胞转变中存在差异。（D）通过实时PCR和测序测定生发中心B细胞到血浆转变中差异表达的miRNA的相对表达。（E）通过实时PCR和测序测定生发中心B到记忆B细胞转变中差异表达的miRNA的相对表达。

图3
**通过高通量测序鉴定新的miRNA**（A）已知和候选新miRNA在正常和恶性B细胞中的分布。样品的排列顺序与表1相同。（B）已知miRNA表达在正常B细胞亚群中的分布。大多数miRNAs在B细胞类型之间共享。（C）候选新miRNA表达在正常B细胞亚群中的分布。大多数miRNAs在B细胞类型之间共享。（D）识别候选新miRNAs的样本比例。大多数miRNAs在多个样本中表达。（E）在另外20个测序数据集中确定的候选新miRNA的比例。（F）在黑猩猩、恒河猴、小鼠和狗中保存新的人类miRNAs。在286个新的miRNAs中，90%在人类和一个或多个附加物种之间被发现是保守的，80%以上在人类和两个或多个子种之间被发现也是保守的。（G）通过另一种测量方法实时PCR验证86个新的miRNAs候选基因。以至少10%的样本表示的miRNAs的最大测量值显示在对数2标度中。检测阈值是C对应的表达水平_T型≤ 35. （H） miRNA分析可区分基于基因表达谱定义的DLCBL分子亚群。ABC是指激活的B细胞，如DLBCL。GCB是指生发中心B细胞样DLCBL。未分类病例是指不符合两组标准的病例。黑色条表示两组间差异表达的候选新miRNAs。

图4
**一种新型miRNA簇的发现和功能验证**（A）mir-2355簇的基因组位点（染色体9q34.3），在3种灵长类动物和另一种哺乳动物（小鼠）中保存，并预测每个miRNA发夹的二级结构，成熟序列以黄色突出显示。序列仅在灵长类中保持不变。（B）通过RNA干扰敲除主要miRNA转录处理酶Drosha，导致已知miRNA簇主要转录物（pri-hsa-mir-17）和新的miRNA簇初级转录物（pre-hsa-mir-2355）的积累。（C） hsa-miR-2355在GCB中的表达高于记忆B细胞。（D）与记忆B细胞相比，GCB和记忆B细胞的H3K4me3抗体染色质免疫沉淀显示，GCB中miR-2355簇的预测核心启动子区域的DNA富集。显示了三组：输入（在不沉淀前使用染色质对PCR进行阳性对照）、使用针对H3K4me3的抗体进行免疫沉淀和使用针对CD20的抗体进行的免疫沉淀（阴性对照）。（E）基因集富集分析得分和TGF-β途径基因在miR-2355簇高表达与低表达转录物中差异表达的转录物等级上的分布。TGF-β途径基因的表达与miRNA的表达呈负相关。

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