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.2010年8月23日；190(4):693-706.
doi:10.1083/jcb.201004082。

通过基质硬化和COX-2抑制反馈放大纤维化

刘飞 1, 贾斯汀·德米赫, 巴里·谢伊, 阿尔文·T·科, 阿斯玛·谢里夫, 安德鲁·M·塔格, 丹尼尔·J·楚姆佩林
附属公司

基质硬化和COX-2抑制对纤维化的反馈放大作用

刘飞等。 J细胞生物学. .

摘要

组织僵硬是纤维化疾病的一个特征，但传统上被视为纤维化的结果，而不是致病因素。在这项研究中，我们发现博来霉素损伤诱导的小鼠肺纤维化使中位组织硬度相对于正常肺实质增加了六倍。在这个病理生理僵硬的范围内，培养的肺成纤维细胞从令人惊讶的静止状态过渡到增殖和基质合成的进行性增加，伴随着基质蛋白水解酶基因表达的协同减少。增加基质硬度会强烈抑制成纤维细胞COX-2（环氧合酶-2）的表达和前列腺素E（2）（PGE（2。外源性PGE（2）或前列腺素EP2受体激动剂可完全抵消僵硬增加引起的增殖和基质合成效应。总之，这些结果证明了正常组织顺应性的主要作用，部分通过自分泌PGE（2）发挥作用，维持成纤维细胞静止，并揭示了基质硬化、COX-2抑制和成纤维细胞激活之间的反馈关系，促进和放大进行性纤维化。

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数字

图1。
图1。
纤维化局部增加肺实质组织的硬度。（A） 新鲜未固定盐水（左）和博莱霉素（右）处理的小鼠肺实质中I型胶原的免疫染色。棒材，100µm。（B） 盐水（左）和博莱霉素（右）处理的小鼠肺实质的典型弹性图。图是从A中确定的各个感兴趣区域的组织中绘制的。颜色条表示剪切模量。最深的蓝色对应于0.05和2 kPa之间的剪切模量值。（C） 生理盐水和博莱霉素（Bleo）治疗肺组织僵硬的发生频率分析。数据表明，在两个独立的博来霉素注射实验中，五只动物的硬度测量值的平均值±SD分别为正常组和纤维化组。（插图）纤维化肺实质的硬度增加以方框图和胡须图表示，其中每个方框内的垂直线代表中间值，每个方框的极限代表四分位范围，胡须代表最大值和最小值。*，使用Mann-Whitney Wilcoxon试验比较纤维化肺实质与正常肺实质的硬度，P＜0.0001。
图2。
图2。
成纤维细胞优先在硬度梯度上聚集。（A） 人肺成纤维细胞用鬼笔肽（红色）染色以显示F-肌动蛋白，Hoechst 33342（蓝色）染色以显示细胞核。播种后4小时，细胞沿刚度梯度均匀附着。120h后，成纤维细胞优先向僵硬区域聚集，细胞形态由圆形向扩散型转变。全景图像是通过沿刚度梯度成像整个凝胶宽度，然后平铺五到七张相邻图片生成的。图像下方的箭头表示缝合位置。（B） 4小时后，细胞密度在整个梯度上保持不变，但到了120小时，细胞在刚度>3 kPa时急剧累积，并在该刚度水平以下消失（注意对数刻度）。密度值标准化为4小时时的整体平均值。（C）血清而非TGF-β1是硬度依赖性细胞积聚所必需的。血清的连续稀释逐渐减弱硬度依赖性堆积行为（黑色，10%FBS；蓝色，1%FBS；绿色，0.1%FBS；红色，0%FBS）。在任何血清浓度下，2 ng/ml外源性TGF-β1对细胞密度（开放符号和虚线）几乎没有影响。（B和C）虚线表示细胞密度值标准化为4小时时获得的全球平均值。（D）底物硬度对成纤维细胞凋亡影响的量化（蓝色表示24小时血清剥夺后显示caspase 3/7活性的细胞百分比）和增殖（红色表示10%FBS中BrdU掺入阳性细胞核的百分比）。标准偏差来自三个独立的实验。（E） 在面板B–D中，沿x轴的彩色三角形用于指示生理盐水（青色）或博莱霉素（红色）治疗小鼠肺实质的四分位间和中间硬度值。（F） 用延时视频显微镜测量成纤维细胞的迁移速度和持久性随基底硬度的变化而变化。误差条表示两个独立实验中每个条件下12个单元格的SD。（G） 从延时视频显微镜获得的刚度梯度凝胶上的成纤维细胞迁移轨迹。每2分钟拍摄一次数字图像，每次实验总共5小时。每个风玫瑰图显示了来自每个指示刚度区域7-10个代表单元的质心轨迹，每个轨迹的初始位置叠加在一个共同原点。棒材：（A）500µm；（G） 50微米。
图3。
图3。
胶原蛋白合成在硬度梯度上增加。（A） 细胞内I型前胶原蛋白表达沿刚度梯度逐渐增加。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）复染。2 ng/ml外源性TGF-β1使I型前胶原蛋白表达降低硬度，并增强更硬底物区域（10%FBS）的表达。棒材，100µm。（B） 在存在（开放符号）和不存在（闭合符号）2 ng/ml外源性TGF-β1的情况下，对在10%FBS中生长的细胞的底物硬度对前胶原I蛋白表达的影响进行量化。（C）COL1A1和COL3A1转录物的表达随着底物硬度的增加而增加，而在0.1%FBS中生长的细胞，MMP1转录物随着硬度的增加而减少。虚线表示基因表达值被归一化为最软底物的值。误差条表示来自一个代表性实验的四个重复样本的SD。（D） 在离散刚度凝胶上生长72小时的成纤维细胞的每细胞净胶原分泌量，细胞生长在1%FBS.*中，与0.1 kPa相比P<0.05。（B和D）误差条表示两个独立实验的SD。（B–D）沿x轴的彩色三角形用于指示盐水（青色）或博来霉素（红色）处理小鼠肺实质的四分位间距和硬度中值。
图4。
图4。
僵硬驱动纤维生成基因程序的协调表达。（A） 对NHLFs（0.1%FBS）增加的底物硬度作出反应的下调转录物的基因表达簇。每行显示三个供体对每个基因的相对表达水平，每个供体的最小系数方差为0.2。每个供体内的柱表示0.1、0.4、1.6、6.4和25.6 kPa时刚度效应的基因表达。根据HUGO命名法，基因与其条目ID一起列出，然后是其符号。层次聚类基于三个捐赠者之间的线性相关性。（B） A中基因功能注释聚类分析的前四个注释簇。每个注释簇中的对应基因在A中的基因名称旁边用相同的颜色标记。（C）从阵列分析中选择刚性调节基因表达。在带有实线和虚线的面板中，虚线表示三个供体的平均数组值，实线表示使用供体1的细胞进行实时qPCR的重复分析。所示数据是相对于刚度为0.1 kPa时的值的平均值。最后一个面板显示了来自三位捐赠者的PTGS1和前列腺素受体PTGER1-4的微阵列数据。虚线上的误差条表示三个捐赠者的SD；实线上的误差条表示使用供体1的细胞进行的三个独立实验的SD。
图5。
图5。
前列腺素E2调节成纤维细胞对增加硬度的反应。（A） 相对PGE2含或不含选择性COX-2抑制剂（NS-398）的NHLF细胞培养上清液中的水平。离散刚度井（1%FBS）中的（B–D）NHLF累积和外源PGE的修改2EP2激动剂（布他前列素；布塔）和COX-2抑制剂（NS-398）。（E） NHLFs（1%FBS）中I型前胶原的免疫染色。EP2激动剂（5µM butaprost）消除了僵硬对I型前胶原表达的影响，而COX-2选择性抑制剂（3µM NS-398）在僵硬较低时无法增加I型前胶原蛋白表达。棒材，50µm。（F） 通过qPCR评估COL1A1在0.1和6.4 kPa底物（0.1%FBS）上的相对mRNA水平，有无5µM布他前列素或3µM NS-398。（A–D和F）误差条表示每个面板三个独立实验的SD。（G） 通过qPCR测定，A549人肺上皮细胞、原代人皮肤、滑膜和肺（NHLF）成纤维细胞、气道平滑肌（ASM）细胞以及CCL-151和IMR90肺成纤维细胞系（0.1%FBS）中COX-2（PTGS2）mRNA水平随硬度的增加而降低。（A–D和G）沿x轴的彩色三角形用于指示生理盐水（青色）或博莱霉素（红色）治疗小鼠肺实质的四分位间和中间硬度值。
图6。
图6。
岩石和PGE2对成纤维细胞产生相互拮抗作用。（A） 增加硬度可增强丝状F-actin细胞骨架（红色）的组织，并触发paxillin阳性局灶性粘连（绿色）的形成。用30 ng/ml外源性PGE逆转刚度对这些细胞结构形成的影响2与使用33µM ROCK抑制剂Y27632（1%FBS）处理相同。（B） 增加刚度会促使α-SMA（绿色）表达并组装成F-actin应力纤维（红色）。30 ng/ml外源性PGE可逆转硬度对α-SMA的影响2与使用33µM ROCK抑制剂Y27632（1%FBS）处理相同。（C） 与未经处理的细胞（CTRL）相比，33µM Y27632在基质硬度条件下（0.1%FBS）增加COX-2（PTGS2）mRNA的表达。误差条表示来自一个代表性实验的三个重复样本的SD。（D） 33µM Y27632平衡内源性PGE2相对于未处理单元（CTRL），矩阵刚度条件下的水平（0.1%FBS）。误差条表示三个独立实验的SD。（C和D）沿x轴的彩色三角形用于指示生理盐水（青色）或博莱霉素（红色）处理小鼠肺实质的四分位间和中间硬度值。（E） 结果与Rho/ROCK和COX-2/PGE的相互拮抗和自我增强效应一致2成纤维细胞中的信号转导。在正常情况下，自动生成PGE2和前列腺素E2周围细胞的贡献，加上正常基质的顺应性，使成纤维细胞保持静止状态。增加基质硬度会抑制内源性COX-2并使成纤维细胞进入激活状态。随后的基质合成对基质合成产生正反馈，导致成纤维细胞持续活化和基质逐渐变硬。棒材，50µm。
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