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.2010年10月29日；285(44):34106-14.
doi:10.1074/jbc。M110.136739。 Epub 2010年8月19日。

抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶：细胞生物能量学揭示线粒体不敏感NAD库

玛丽亚·皮泰利 1, 劳拉·福门蒂尼, 朱塞佩·法拉科, 安德烈亚·拉普奇, 埃琳娜·拉皮齐, 弗朗西丝卡·恰尔代, 乔瓦尼·罗曼诺, 格洛里亚诺·莫内蒂, 弗拉维奥·莫罗尼, 阿尔贝托·齐亚鲁吉
附属公司

抑制烟酰胺磷酸核糖转移酶：细胞生物能量学揭示线粒体不敏感NAD库

玛丽亚·皮泰利等。 生物化学杂志. .

摘要

NAD拯救途径由烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）和烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶操作的两个酶步骤组成。最近，有效的Nampt抑制剂FK866已在抗癌临床试验中得到鉴定和评估。然而，Nampt抑制如何影响NAD含量和生物能量学尚不清楚。NAD拯救是否发生在线粒体中也不清楚，FK866改变了细胞器内NAD的稳态。在这里，我们表明，依赖FK866的NAD含量减少与各种细胞类型中伴随的ATP增加相平行，这与ATP在NAD再合成中的利用相一致。我们还表明，多和单（ADP-核糖）转移酶而非Sirt-1是FK866暴露HeLa细胞NAD耗竭的原因。质谱显示药物分布在细胞溶质和线粒体室。然而，急性或慢性接触该药物后，细胞质NAD库减少，而线粒体NAD库不减少。因此，Nampt不定位于细胞器内，其生物能量学不受药物影响。在小鼠中，多（ADP-核糖）聚合酶抑制剂或NAD前体犬尿氨酸可阻止FK866依赖性的各种器官中NAD含量的降低。我们的数据首次表明线粒体缺乏典型的NAD拯救途径，拓宽了目前对细胞生物能量学的理解。

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数字

图1。
图1。
FK866对基础和PARP-1激活条件下不同细胞培养物中NAD和ATP含量的影响。FK866对NAD的浓度依赖性效应(一)和ATP(B类)不同培养细胞类型中的含量。NAD和ATP的基本含量在不同细胞类型之间具有可比性，分别包含10.4±4.4和23.5±7.8 nmol/mg蛋白质。FK866在100μ米和100 n米NAD上(C类)和ATP(D类)HeLa细胞中的含量。FK866（100μ米，30分钟预培养）(E类)和ATP(F类)PARP-1激活化合物MNNG（100μ米). 每个点/列代表至少三个重复实验的平均值±S.E。
图2。
图2。
各种化合物对FK866诱导的HeLa细胞NAD耗竭的影响。 一PARP-1抑制剂PHE、MART抑制剂新生霉素的作用(11月)和mIBG，以及Sirt-1抑制剂EX-257(前任)FK866（100μ米/1小时）。每种药物在指定浓度下预培养30分钟。B类，PARP-1抑制剂PHE的加性效应（30μ米)和MART抑制剂新生霉素(11月，1米米)和mIBG（100μ米)FK866（100μ米/1小时）。C类FK866、PARP-1抑制剂PHE和MART抑制剂新生霉素的作用(11月)和mIBG（均为100μ米)上的体外纯化PARP-1的活性。D类，犬尿素的作用(KYN公司, 200 μ米)和犬尿氨酸单加氧酶抑制剂Ro-618048（Ro，30μ米)在控制条件下或暴露于FK866（100μ米/1小时）。KYN和RO已经预培养60分钟。每个柱代表重复进行的三个实验的平均值±S.E。一, *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与FK866。B类, *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与控件。D类, *,第页< 0.05; **,第页< 0.01与控制；§,第页< 0.05,与FK866。采用方差分析和Tukey的事后检验。
图3。
图3。
FK866对亚细胞NAD含量、聚ADP-核糖形成和ATP生成的影响。100μg FK866暴露HeLa细胞胞浆和线粒体NAD含量的定量米持续1小时(一)或100 n米24小时(B类).C类，FK866（100 n）效果的Western blotting评估米/24）在聚（ADP核糖）上(标准)PARP-1激活剂MNNG（100μ米). 注意，聚ADP核糖基化蛋白由于其分子量的高度增加而表现为涂片。D类，在控制条件下或在100μ米持续1h或100n米持续24小时。E类，细胞自身荧光定量显示于D.F公司，接触或不接触100 n的细胞的ATP含量米FK866 24小时，在没有葡萄糖的情况下培养过夜，并用1米脉冲处理1小时米丙酮酸盐(PYR公司). 数值表示在葡萄糖存在下培养的细胞的ATP百分比(控制).G公司，从对照细胞或FK866激发细胞中分离的线粒体产生ATP，并暴露5分钟至1米米丙酮酸盐(PYR公司)或1米米丙酮酸盐加3μ米ADP公司。在一,B类,F类、和G公司，每列代表7的平均值±S.E(一), 5 (B类)，或3(F类和G公司)实验。在C类这个印迹是三个不同实验的代表。在D类给出了4的一个代表性实验。在E类每列代表每个显微镜视野中荧光的平均值±S.E.（已采集每张幻灯片的3个视野）。一和B类, *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与控件。采用方差分析和Tukey的事后检验。
图4。
图4。
LC-MS/MS评估HeLa细胞中FK866的细胞溶质和线粒体浓度。 一，FK866碎片的离子跃迁光谱。B类暴露于100μ米1 h。数值为三个独立实验的平均值。
图5。
图5。
Nampt在HeLa细胞中的亚细胞定位。 一对整个提取物或细胞质、细胞核和线粒体部分的Nampt进行Western blot分析。细胞凋亡诱导因子(AIF公司)显示为线粒体标记。B类，用胞质GFP转染的细胞的荧光(细胞-GFP)图中显示了Nampt-GFP或mit-GFP及其线粒体的TMRE染色。合并绿色和红色还显示了荧光。注意，TMRE荧光变为黄色的与源自mit-GFP的合并后红色或出现橙色与Cyt-GFP或Nampt-GFP合并后。C类，由分隔的区域的放大倍数虚线在里面B类如图所示。请注意，表达Nampt-GFP的细胞胞质区TMRE阳性线粒体的负片。在一图中显示了两个具有代表性的斑点。在B类和C类，给出了3个实验的典型图像。酒吧=4微米(一)和0.2微米(B类).
图6。
图6。
PARP-1抑制增加犬尿氨酸途径对FK866对小鼠不同器官NAD含量的影响。小鼠腹腔注射FK866（100 mg/kg），皮下注射PARP-1抑制剂PJ34（10 mg/kg）或犬尿氨酸（100 mg/kg/kg），8h后测定不同组织中NAD含量。每列代表5只小鼠的平均值±S.E.。*，第页< 0.05与车辆。采用方差分析和Tukey的事后检验。
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