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.2010年10月；52(4):1443-54.
doi:10.1002/hep.23829。

来自间充质细胞群的旁分泌信号控制人类肝干细胞向成人肝脏命运的扩张和分化

王云芳 1, 新雷尧, 崔彩斌, 埃利亚娜·沃瑟尔, 克莱尔·巴比尔, 马丁·科斯特洛, 尼古拉斯·莫斯, 山内光雄, 马尔尼萨·斯里乔尔佩奇, 大卫·格伯, 伊丽莎白·G·洛沃亚, 洛拉·里德
附属公司

来自间充质细胞群的旁分泌信号控制人类肝干细胞向成人肝脏命运的扩张和分化

王云芳等。 肝病学. 2010年10月.

摘要

在已知条件下，将胚胎干细胞或确定的干细胞群体分化为成人肝脏命运，产生具有某些成人特异基因而非其他基因的细胞，一个或多个基因的异常调节，以及不同实验结果的差异。我们测试了一种假设，即新分离的、谱系依赖的间充质细胞群体产生的信号集将在驱动人类肝干细胞（hHpSCs）分化为成人肝脏命运方面产生更高的效率和再现性。通过免疫选择技术纯化的肝源性间充质细胞亚群包括（1）成血管细胞、（2）成熟内皮细胞、（3）肝星状细胞前体、（4）成熟星状细胞（周细胞）和（5）肌成纤维细胞。在我们为短期培养开发的完全确定的（无血清）条件下，在原代培养物中建立这些亚群的新鲜免疫选择细胞，并将其用作hHpSCs的饲养者。成血管细胞饲养者产生自我复制，星状细胞前体对成肝细胞造成谱系限制，成熟内皮细胞分化为肝细胞，成熟星状细胞和/或肌成纤维细胞分化为胆管细胞。通过生化、免疫组织化学和定量逆转录聚合酶链反应分析，确定不同饲养者产生的旁分泌信号，然后用这些信号替换单层和三维培养的饲养者，以从hHpSC中激发所需的生物反应。定义的旁分泌信号被证明能够从hHpSCs产生可重复的反应，并允许分化为完全成熟的功能性薄壁细胞。

结论：来自确定的间充质细胞群体的旁分泌信号对于将干细胞群体调节为特定的成体命运是重要的；这一发现对基础和临床研究以及工业研究都很重要。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露：提交人声明不存在利益冲突。

数字

图1
图1。间充质细胞亚群
血管母细胞（A）聚集物呈VEGFR2（KDR）（A）阳性，边缘有单个星状细胞前体CD146阳性（粉红色，箭头）和其他未显示的标记物（结蛋白，ASMA，β-3整合素）（2，21）。所有被评估的间充质细胞群体的CD45均为阴性（数据未显示）。成熟的内皮细胞（B）在单层培养中形成细胞的漩涡聚集体，如果嵌入透明质酸或基质中，则形成管状结构。内皮细胞强烈表达CD31（红色）和vWF（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。从成血管细胞聚集物中分离出来的星状细胞前体（C）较短（<10μm），其细胞核位于细胞的一端，类似于“逗号”。成熟星状细胞在成人肝细胞悬液中大量存在；新镀时（D）；它们是双极细胞，长度至少为15-20μm，细胞核位于中央。随着培养时间的延长，尤其是暴露于血清后，它们会更长（它们的长度可以达到50μm，并且表达高水平的ASMA）。比较CD146在前体细胞和活化星状细胞中的表达。E： 基体成分的qRT-PCR分析在新鲜分离的肝间充质细胞中。F=胎儿；A=成人。CD117=成血管细胞（CD117+/VEGFr2+）；CD31=内皮细胞；CD146=星状细胞。对来自胎儿或成人不同细胞亚群的cDNA进行逆转录，并对基质分子进行qRT-PCR分析。所检测的蛋白多糖包括HS-PG2（perlecan）、GPYC（glypican）和SDC2（syndecan 2）；检测的胶原蛋白包括胶原蛋白1（C1A1）、3（C3A1）、4（C4A5）和5（C5A2）；检测的基础粘附分子为层粘连蛋白（LA4、LB2、LB3）和纤维连接蛋白（FN）的亚型；还分析了弹性蛋白（ELS）。每个矩阵成分的6个细胞亚群中最大值的数据被赋予100%的值，并用于标准化其他细胞亚群的数据。因此，其他细胞群产生的基质成分的数量是这个最大值的一部分。这使得人们可以看到，HS PGs、层粘连蛋白、弹性蛋白和III型和IV型胶原的形式在内皮细胞谱系中占主导地位，而所有的胶原、蛋白多糖、纤连蛋白和弹性蛋白在星状细胞谱系中占主导地位。条形图表示标准偏差，n=6。
图2
图2。hHpSCs（A-C）与hHBs（D-E）的菌落
hHpSCs表达EpCAM（绿色）、NCAM（红色）（A），而hHBs（D）表达EpCAM（红色）和AFP（红色）；细胞核DAPI染色（蓝色），比例尺=100μm。菌落的相位图像表明，小hHpSC紧密结合，在菌落边缘有一个升高的区域，在那里发现了最多的成血管细胞。相比之下，hHBs的菌落包含由透明通道、胆管散布的实质细胞索。hHpSC集落（C）的超微结构图像显示，间充质细胞沿其长度与hHpSCs紧密结合；间充质细胞和hHpSCs中几乎没有桥粒，只有小束中间丝（IF）。相比之下，hHB菌落（F）的超微结构图像显示，hHBs和间充质细胞之间的边界部分分离，但与连接在间充质电池中的桥粒结合在一起，形成大束中间丝。箭头=桥粒；箭头=微绒毛。
图3
图3。hHpSCs与间充质伙伴的菌落
与hHpSC相关的间充质细胞有两种类型：集落内的成血管细胞和外围的星状细胞前体。第（A）阶段和NCAM（B）染色后显示的hHpSCs集落。NCAM（红色）见于成血管细胞（NCAM+、CD117+、vWF+）和hHpSCs（2）。成血管细胞散布在整个菌落中，尤其是在菌落边缘。星状细胞前体（21）在集落外部和周围发现，并且通过ASMA染色很容易识别（绿色）。放大倍率，10×。（D） 是a、B和C的合并图像，显示干细胞集落边缘NCAM和ASMA的表达重叠。（E） 显示两个相邻hHpSC菌落的相位对比图像；右边的一个与成血管细胞相关，处于静止状态，在这种状态下，hHpSC自我更新；另一个菌落与肝星状细胞前体（以及存在但在所用染色中无法看到的内皮细胞前体）相关，导致hHpSCs菌落延伸出的hHBs索状突起，F显示与E染色的CD146（黄色/绿色）和白蛋白（红色）相同的菌落。
图4
图4。自我更新的条件
如果HHpSC在成血管细胞（A）的饲养者或纯化的III型胶原（B）的基质上作为单层维持，或嵌入到弱交联HA水凝胶中，其中hHpSC形成聚集物或细胞球（C），则HHpSCs可以自我复制。在这三种条件下，hHpSCs可以在数周内自我更新，在培养塑料上每36小时分裂一次，在III型胶原蛋白上每20-24小时分裂一个。水凝胶（D和E）中hHpSCs的TEM表明细胞的聚集体，其外层通过许多微绒毛与水凝胶界面连接，这些微绒毛在E中用虚线勾勒。细胞直径约为7-9μm，核质比较高。高倍镜下，界面细胞似乎有少量未发育的内质网（ER）、线粒体（M）、微绒毛下的粗糙和游离核糖体（R），这是未成熟未分化肝实质细胞的特征。
图5
图5。hHBs的血统限制
当在星形细胞前体饲养器（A、D和E）上生长时，hHpSCs谱系在24小时内限制为hHBs。喂食器可以用IV型胶原或层粘连蛋白（B）或交联透明质酸（C）的基质代替。这些基质成分的组合产生了相同的结果，即具有AFP表达（C）的细胞、PAS染色证明的糖原合成（D）、表达成肝细胞表型（E）的细胞缺乏ICG摄取和分泌。交联透明质酸水凝胶也产生了这一结果，表明凝胶硬度所产生的机械力是血统限制的因素（D）。hHBs（F）的超微结构图像显示，它们之间的连接比hHpSC松散得多，并且胆管（BC）通过细胞表面紧密连接和稀疏的微绒毛与细胞间隙的其余部分分离。这些细胞的细胞核呈椭圆形，细胞质稀少，内质网不成熟，线粒体和核糖体。
图6
图6。产生成熟肝细胞的条件
如果将细胞镀入MKM中，并进一步添加肝细胞因子（MKM-H）和内皮细胞饲养者（A、B），则细胞在7-10天内即可完全分化为肝细胞。取而代之的是将细胞植入40%水凝胶（HA或Matrigel）、60%IV型胶原蛋白和层粘连蛋白以及MKM-H（C）的混合物中。细胞表现出强烈的白蛋白表达（C和E）、糖原（C）、ICG摄取和排泄（D）和尿素分泌（E），肝细胞透射电镜显示典型的微观结构，包括细胞质中大量球形细长线粒体、高尔基复合体、溶酶体和内质网（B）。白蛋白分泌和尿素合成的定量测量如E.Student的t检验所示，n=3，数据为平均值±SEM。*，P（P）<.05和**，P（P）<.01用于比较。M=线粒体，G=高尔基体；L=溶酶体；ER=内质网。
图7
图7。产生成熟胆管细胞的条件
在7-10天内形成胆管结构需要在MKM-C（MKM补充VEGF、HGF）中培养hHpSC，并将其镀在成熟的星状细胞（周细胞）或肌成纤维细胞（A）上。可以通过将细胞包埋在60%I型胶原凝胶和40%水凝胶（透明质酸或基质胶）的混合物中以及为胆管细胞量身定制的HDM（B-E）中来代替喂食器。这些细胞形成分支导管和管，表达细胞角蛋白19（绿色）和分泌素受体（红色）（E）以及胆管细胞的其他标记物（例如水通道蛋白、ABAT，数据未显示）。B中的图像由多个图像组成，显示水凝胶/基质混合物中的大菌落。C和D中的图像是B中菌落的一些导管的放大图。
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