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.2010年9月；24(9):1588-98.
doi:10.1038/leu.2010.152。 Epub 2010年7月29日。

慢性淋巴细胞白血病的异常O-GlcNA酰化特征

Y Shi先生 1, J托米奇, F Wen先生, S沙哈, 巴赫洛人, R哈里森, J W丹尼斯, R威廉姆斯, B J总量, S Walker公司, J祖科洛, J P院长, G W Hart公司, D E扳手
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慢性淋巴细胞白血病的异常O-GlcNA酰化特征

Y Shi先生等。 白血病. 2010年9月.

摘要

O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）翻译后修饰源于己糖途径的活性，已知会影响细胞内信号传递过程。由于对微环境信号的异常反应是慢性淋巴细胞白血病（CLL）的一个特征，因此在原代CLL细胞中测定了O-GlcNAcylated蛋白水平。与正常循环和扁桃体B细胞相比，CLL细胞表达高水平的O-GlcNAcylated蛋白，包括p53、c-myc和Akt。CLL细胞中的O-GlcNAcylization在细胞因子和类toll受体（TLR）激活后增加，或在负载己糖途径底物后增加。然而，高基线O-GlcNAc水平与TLR激动剂、化疗药物、B细胞受体交联和有丝分裂原的信号传导反应受损有关。CLL细胞的吲哚和攻击性临床行为分别与较高和较低的O-GlcNAc水平相关。这些发现表明细胞内O-GlcNAcylization与CLL的发病机制有关，这可能具有潜在的治疗意义。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中的己糖胺途径活性。(一)表明相关酶（例如，O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）转移酶（OGT）、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶（GFAT））和分子（例如，OGT抑制剂）的己糖途径的模式。(b条)上图：用RL2抗体对三个新鲜分离的正常外周血单个核细胞（PBMC）和五个CLL样品的裂解液进行免疫印迹，并用密度测定法（RL2指数）进行定量，如材料和方法中所述以及上述印迹所示。底部：四个额外的CLL样本、另一个PBMC样本、纯化的循环成人B细胞和IgD的结果+和IgD−图示为两个正常扁桃体的B细胞。用RL2和抗OGT和O-GlcNAcase（Ogase）的多克隆抗体对提取物进行检测。其他三个扁桃体样本也有类似结果。(c（c）)用RT-PCR检测GFAT1和GFAT2同工酶的表达。凝胶的示例显示了与次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）相关的转录水平。(d日)PBMC中尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）水平(n个=6）和CLL电池(n个=19），通过HPLC测定，CLL细胞中的含量通常高于正常细胞（圆圈）。(e（电子）)从新鲜分离的CLL细胞中提取的蛋白通过含有RL2抗体的蛋白a柱，并用所示蛋白的抗体鉴定免疫沉淀蛋白。
图2
图2
免疫受体激动剂和己糖途径底物对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞O-GlcNA酰化的影响。(一)来自基线O-GlcNAc水平相对较低的患者26和111的样本与指示浓度的X1孵育30分钟，然后分别用IL2（100 U/ml）、852A（0.1μg/ml）（左图）或干扰素-2b（1000 U/ml）（右图）刺激。1h后提取提取物，并用RL2抗体进行免疫印迹。通过密度测定法测定RL2染色相对于β-肌动蛋白水平的强度，并显示在每个车道下方。其他两个样品也获得了类似的结果。(b条)X1的化学结构。(c（c）)患者46的CLL细胞在AIM-V中单独培养2天，与O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）转移酶（OGT）抑制剂X1（50μM）或GlcNAc（20 mM）和尿苷（5 mM）（GU）一起培养，为OGT提供底物。然后用RL2和活化Akt抗体检查蛋白质提取物T308电话通过密度测定法对与β-肌动蛋白相关的染色强度进行量化（右侧面板）。GU增加O-GlcNAc水平并降低AktT308电话而X1则有相反的作用。(d日)细胞大小由流式细胞仪的前向散射参数指示。用GU处理的细胞较小，而用X1处理的细胞略大于单独培养的细胞。直方图中的数字是M1区域的平均值。该图总结了其他八个CLL样本（患者128、133、171、172、173、125、26和174）的结果，并显示了因己糖途径底物负载导致的细胞大小差异的平均误差和标准误差(P（P）八个样本的<0.02）。
图3
图3
改变O-GlcNAc水平对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中toll-like receptor（TLR）-7信号转导的影响。(一)在用TLR-7激动剂852A（0.1μg/ml）刺激前，将患者116的CLL细胞单独培养过夜，或在GlcNAc和尿苷（GU）中培养过夜。RL2抗体的免疫印迹证实O-GlcNAcylated蛋白水平增加（中间面板），通过密度测定法（相对于β-actin水平）进行量化（右侧面板）。4h后用流式细胞术检测CD83和肿瘤坏死因子（TNF）-α的表面表达（以反映TLR-7信号）。右上象限中的数字是表达膜TNF-α（mTNF-β）的CLL细胞的百分比。(b条)164名患者的CLL细胞单独培养24小时或与OGT抑制剂X1（50μM）共同培养24小时，以降低O-GlcNAcylation（经RL2抗体免疫印迹和密度测定证实），然后用852A刺激。其他10个样品的TNF-α产量也有类似的增加。(c（c）)患者80（左面板）和患者125（右面板）的CLL细胞在有无GU的情况下培养过夜，然后用852A刺激。在指定的时间，收集蛋白质提取物，并通过免疫印迹法检测磷酸化和总c-Jun N末端激酶（JNK）、IκB以及RL2的表达，以确认O-GlcNA酰化蛋白水平的增加。其他两个样品也有类似的结果。
图4
图4
细胞内O-GlcNA酰化变化对化疗药物、B细胞受体交联和佛波酯反应的影响。慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞在有无GlcNAc和尿苷（GU）的情况下培养过夜，并用(一)长春新碱（0.3μg/ml）（患者80（左）和173（右））或(b条)抗人IgM抗体（10μg/ml）（患者108（左）和21（右））。在0、10、30和60分钟收集提取物，并表达磷酸化和总JNK和IκB（长春新碱）、细胞外信号调节激酶（ERK）以及SykYY525/526年（用于BCR激活），以及RL2，以确认O-GlcNA酰化增加，通过免疫印迹法进行检测。对于每个刺激，在另外两个样本中也看到了类似的结果。(c（c）)对来自患者152、113、74、149、155、130、1、5、26、55、38和154（实心钻石）和三名正常供体（开环）的新鲜分离的CLL细胞进行纯化，并立即用二丁酸佛波酯（PDB）（100 ng/ml）刺激。CD19上CD83表达的平均荧光强度差异+4h后用流式细胞仪检测B细胞与未刺激细胞的比较。使用新鲜细胞的蛋白质提取物测定RL2指数。结果表明，细胞内O-GlcNAcylated蛋白基线水平较高的CLL细胞对PDB刺激反应较低。
图5
图5
细胞内O-GlcNA酰化与临床参数的相关性。对41例临床特征如表1所示的患者，测定了新分离的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的RL2指数。临床Rai阶段(一)，CD38表达(b条)，淋巴细胞倍增次数(c（c）)症状性疾病的治疗次数(d日)和细胞遗传学异常（无或13q缺失被视为“低风险”，任何12、11q或17p三体缺失被认为“高风险”）(e（电子）)相对于RL2指数绘制。开放的圈子(b条,e（电子）)代表未纳入统计分析的患者。侵袭性疾病患者细胞内O-GlcNAcylated蛋白水平显著降低，如P（P）-各个面板中的值。
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参考文献

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