Recording single-channel activity of inositol trisphosphate receptors in intact cells with a microscope, not a patch clamp

doi:10.1085/jgp.200910390

.2010年8月；136(2):119-27.

doi:10.1085/jgp.200910390。

用显微镜而非膜片钳记录完整细胞中肌醇三磷酸受体的单通道活性

伊恩帕克¹, 伊恩·史密斯

附属公司

PMID： 20660654
预防性维修识别码：项目经理2912063
内政部： 10.1085/jgp.200910390

用显微镜而不是膜片钳记录完整细胞中肌醇三磷酸受体的单通道活性

伊恩帕克等。 J Gen Physiol杂志. 2010年8月.

.2010年8月；136(2):119-27.

doi:10.1085/jgp.200910390。

作者

伊恩帕克¹, 伊恩·史密斯

附属

¹美国加州大学欧文分校神经生物学与行为系，加利福尼亚州欧文市，邮编92697。

PMID： 20660654
预防性维修识别码：项目经理2912063
内政部： 10.1085/jgp.200910390

摘要

光学单通道记录是一种新的工具，用于在最小扰动的生理条件下研究完整细胞内的单个Ca2+通透性通道。应用于知识产权的功能和空间组织时，这种方法补充了我们现有的知识，这在很大程度上源于减少的系统，如重组成脂质双层和切除细胞核膜上IP3R的膜片钳，其中IP3R通过CICR的空间排列和相互作用被破坏。以毫秒分辨率对单个IP3R通道的活动进行成像的能力，以及以几十纳米的精度对其位置进行定位的能力，都提出了几个有趣的问题，并有望得到答案。特别是，是什么机制使烟团和光点锚定在静态位置；为什么这些Ca2+释放事件似乎只涉及细胞内IP3Rs的一小部分；我们如何将功能性IP3R的相对不活动性与众多报道IP3R蛋白在ER膜中自由扩散的研究相协调？

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数字

**图1。**
剖析IP的层次结构_三-介导钙²⁺从全球细胞振荡到单通道事件的信号传递。（A）荧光痕迹显示全球钙²⁺负载fluo-4和ciIP的SH-SY5Y细胞中强（800ms）紫外线光解闪光诱发的振荡_三.（B）局部钙²⁺i-IP弱光释放（100-ms闪光）诱发的喘息_三在另一个单元格中。（C）图中显示了一个Ca²⁺在单个视频帧峰值振幅时捕获的烟团（绿色假彩色），叠加在SH-SY5Y细胞中静止的荧光-4的单色图像上。痕迹显示钙的剖面²⁺-沿着穿过烟团中心的虚线测量的相关荧光。（D和E）钙²⁺细胞内负载EGTA后，分别由与A和B中相同的强光解闪光和弱光解闪光诱发的烟团。全球响应被取消，而痕迹显示了从以烟团为中心的感兴趣小区域测得的局部信号。（F）图像显示Ca²⁺烟团和相应的荧光剖面，如C中所示，但在存在EGTA的情况下记录。（G） iIP光释放后SH-SY5Y细胞中记录的代表性烟团的比较_三使用宽场荧光显微镜（灰色痕迹），使用TIRF显微镜和EGTA加载（黑色痕迹）。两种示踪均显示荧光比率变化（ΔF/F₀)以烟团为中心的1×1µm感兴趣区域内的平均值。（H）仅显示单通道blip活动的站点示例。（一）插图显示Ca²⁺来自1-µm的信号²感兴趣的区域，在一次吞吐期间显示五个离散振幅水平。直方图显示了事件和阶跃振幅的分布，这些振幅来自于20个细胞中87个位置的测量，揭示了单通道水平整数倍的“量子”成分。A–F改编自Smith等人（2009a），G–I改编自Smish和Parker（2009）。

**图2。**
IP拟议安排示意图_三Rs是产生光点和烟团的基础。（A）使用TIRF显微镜观察到的SH-SY5Y细胞中静息氟-4荧光的单色图像，绘制了对光释放IP反应显示单通道光点活性的位点_三（黑色圆圈）和显示烟团的站点（白色圆圈）。（B）轨迹显示了从一个闪电站点记录的活动实验数据。卡通展示了我们建议的IP安排和活动_三与跟踪期间三个点中的每个点对应的R个通道。每次闪烁期间打开的通道以红色显示，关闭的通道以黑色显示。两者都对IP敏感_三绑定到一个尚未确定的锚固点（用绿色表示）。移动、功能无响应的IP_三R以灰色显示。（C）相应的痕迹和漫画说明了IP的定位和活动_三喘息时的R通道。灰色线表示对应于单通道（blip）水平整数倍的荧光水平。第一次吹气（左）在其峰值同时打开六个通道，而第二次吹风（右）只打开两个通道。据信，形成烟团的通道分布在直径约为400 nm的星团中。

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