A spatio-temporal analysis of matrix protein and nucleocapsid trafficking during vesicular stomatitis virus uncoating

doi:10.1371/journal.ppat.1000994

.2010年7月15日；6（7）：e1000994。

doi:10.1371/journal.ppat.1000994。

水疱性口炎病毒脱衣过程中基质蛋白和核衣壳转运的时空分析

乍得E沼泽¹, 朱迪思·M·怀特, 迈克尔·惠特

附属公司

PMID： 20657818
预防性维修识别码：项目经理2904772
内政部： 10.1371/日志.ppat.1000994

水疱性口炎病毒脱衣过程中基质蛋白和核衣壳转运的时空分析

乍得E沼泽等。公共科学图书馆病理学. 2010.

.2010年7月15日；6（7）：e1000994。

doi:10.1371/journal.ppat.1000994。

作者

乍得E沼泽¹, 朱迪思·M·怀特, 迈克尔·惠特

隶属关系

¹美国田纳西州孟菲斯市田纳西大学健康科学中心分子科学系。

PMID： 20657818
预防性维修识别码：项目经理2904772
内政部： 10.1371/日志.ppat.1000994

摘要

为了研究病毒脱膜过程中VSV的进入和传入基质（M）蛋白的命运，我们使用了编码M蛋白的重组病毒，该M蛋白带有C末端四胱氨酸标签，可以使用双砷（Lumio）化合物进行荧光标记。我们发现脱膜在内吞途径的早期发生，并被显性阴性（DN）Rab5的表达抑制，但不被DN-Rab7或DN-Rab11抑制。解包，定义为核衣壳与M蛋白的分离，发生在进入后15至20分钟之间，不需要微管或完整的肌动蛋白细胞骨架。出乎意料的是，大部分M蛋白在脱膜后仍然与内胚体膜相关，最终被转运到回收的内胚体。另一小部分但很重要的M分布在核孔复合体中，也不依赖微管或聚合肌动蛋白。高分辨率共焦显微照片的荧光定量显示，膜融合后，M蛋白在内胚层膜上扩散，同时Lumio标记的荧光也随之增加，这是RNP释放到细胞质后不久发生的。这些数据支持一种新的VSV脱膜模型，即膜融合后复合物释放到细胞质中后，RNP从M释放出来，而不是M蛋白从RNP中分离出来。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。DN-Rab表达对VSV感染的影响。**
用表达DN或wt-Rab-eGFP蛋白的质粒转染细胞，并在转染后18小时感染rVSV-wt或流感病毒。细胞在感染后8小时固定、渗透并染色以检测VSV N蛋白或流感NP。（A）荧光和亮场显微照片显示DN-Rab5（顶部面板）、DN-Rab7（中间面板）和DN-Rab11（底部面板）对VSV感染的影响。箭头标记表达Rab-eGFP蛋白的细胞。（B）通过测定也感染了VSV或流感病毒的Rab阳性细胞的数量来量化病毒感染的抑制作用。使用152个细胞（Rab5）、153个细胞（Rab7）或156个细胞（Rab11）的Student t检验（*=p<0.002）确定对VSV感染影响的统计学显著性。

**图2。表面结合的Tfn-TR和rVSV-MLG的胞吞作用。**
rVSV-MLG和Tfn-TR在4°C下与细胞结合90分钟，细胞立即用冰镇3%多聚甲醛（t-0）固定（顶部面板），或用酸性去铁胺处理（中部面板），从细胞表面（t-0，AW）剥离Tfn-TR，然后固定，或（底部面板）将接种物替换为37°C培养基加热2分钟，然后添加冰镇PBS快速冷却，然后在冰上清洗酸脱铁胺。酸洗后，将细胞加热至37°C，再培养3分钟（t-5，AW），然后在加热阶段用LSCM进行检查，但不固定。棒材=5µm。DIC=差分干涉对比度。

**图3。M蛋白在活细胞中的脱膜和分布。**
细胞在4°C下接种rVSV-MLG和Tfn-TR 90分钟，然后立即用冰镇3%多聚甲醛（t-0）固定或通过添加37°C培养基快速加热，并由LSCM在指定时间在加热台上进行检查，无需固定，每个时间点使用单独的35mm玻璃底皿，以减少光漂白造成的信号损失。棒材=10µm。箭头表示MLG向NPC本地化。

**图4。MLG在核膜上的定位。**
（A）用巴非霉素A1（Baf）预处理BHK细胞，然后将rVSV-MLG和Tfn-TR在含有Baf的冷培养基中与细胞结合90分钟。取下接种物，将细胞在37°C的含有Baf的培养基中培养150分钟。细胞通过LSCM成像，如图3所示。棒材=10µm。（B）细胞在NH存在下感染rVSV-MLG₄Cl作用90分钟，使病毒在内体中积聚，然后通过在无NH的培养基中培养开始进入₄氯，但含有环己酰亚胺，以防止新的病毒蛋白合成。将细胞固定在t-0（上图）和t-60（下图），使用罗丹明缀合的抗-MmAb（红色）和用Alexa Fluor-647（蓝色）标记的Nup62抗体对M蛋白进行染色，并通过LSCM进行检查。白色箭头表示MLG在核膜上的定位。请注意，M单抗没有检测到定位于核膜的M蛋白（中间面板，黄色箭头）。棒材=2µm。

**图5。细胞松弛素D或诺康唑存在时MLG的分布。**
BHK细胞在NH存在下感染rVSV-MLG₄Cl如图4B所示。NH前加入细胞骨架抑制剂30分钟₄Cl冲洗和抑制剂保留在冲洗后培养基中，直到60分钟后细胞固定。MLG、Nup62和肌动蛋白（A）或微管蛋白（B）在没有（顶部面板）或（底部面板）细胞骨架抑制剂的情况下的分布。箭头表示核膜定位。使用Canvas 11软件调整所有图像的亮度级别，以在转换为灰度后最大化MLG信号。棒材=10µm。

**图6。利用标记物对MLG进行染色，以回收内体。**
如图4B所示，进行同步融合分析，将细胞固定在t-60处，对（A）LAMP-1、（B）甘露糖-6-磷酸受体、（C）Tfn-TR或（D）Rab11进行染色，然后用LSCM检查（Bars=10µm）。合并图像的右上角显示了来自两个独立实验的大约20个单个细胞的MLG与指示标记的共定位百分比。

**图7。从MLG-内体中分离RNP的动力学。**
（A）如图3所示，rVSV-MLG在低温下与细胞结合，但省略了Tfn-TR。在指定的时间固定细胞，使其透化，并通过使用与Alexa Fluor-568缀合的N mAb对N蛋白进行染色来检测RNP。LSCM使用相同的探测器、偏移和增益设置收集图像。棒材=10µm。（B）（A）中图像的RNP与MLG的彩色化，作为进入后时间的函数。通过Student t检验（n=9个细胞）确定显著性。（C）在Adobe Photoshop中调整了来自（A）的t-5和t-60图像的红色和绿色通道电平，以提供类似的红色和绿光强度，这表明在t-5时间点，LSM软件检测到的MLG与RNP的共定位效果更好。

**图8。病毒进入过程中RNP和M蛋白的细胞分离和分布分析。**
将rVSV-wt在放线菌酮存在下的低温下与细胞结合90分钟，以防止新的蛋白质合成，取出接种物并清洗细胞，然后立即从培养皿中取出（t-0）或加热至37°C，然后在指定的时间收获进行分馏。使用多克隆抗VSV血清对组分进行免疫印迹分析。免疫印迹的相关区域如图所示。NV（无病毒）表明细胞被模拟感染并在t-0收获。印迹下方的图表显示了每个组分中N或M蛋白的定量。（A）在P16（质膜相关病毒）和NDG颗粒（耐洗涤剂核衣壳）组分中检测到N蛋白。输入后的时间显示在免疫印迹上方。VSV N是一条含有纯化病毒的通道。（B）在S16（质膜和线粒体膜）和NDG上清液（内膜和核膜）部分检测到M蛋白。NV（无病毒）模拟感染细胞。VSV M是含有纯化病毒的通道。（C）这四个组分用针对所示细胞标记物的抗体进行检测。

**图9。诺康唑存在下内体RNP的释放和病毒蛋白的合成。**
NH后t-0（A）和t-120（B和C）接种rVSV-MLG的细胞的共焦图像₄在环己酰亚胺和诺卡唑（B）或仅在诺卡唑中氯洗脱，并使用与Alexa Fluor-568偶联的N单克隆抗体对VSV N蛋白进行染色。使用LSM软件3.2版中的共定位功能，对50个单个细胞的共定位量进行量化。与MLG共定位的N蛋白百分比表示为t-0和t-120（N=50个细胞）。棒材=5µm。

**图10。病毒进入和脱膜期间MLG的时空分布。**
如图4B所示，使用rVSV-MLG（A）或“秃顶”ΔG-MLG（B）进行同步进入分析，并在添加37°C培养基15分钟后对细胞成像。使用LSM软件的“裁剪”功能将具有高浓度内体的区域放大到500倍，以显示含有MLG和Tfn-TR的胞内囊泡。箭头显示了rVSV-MLG感染细胞中，MLG在Tfn-TR阳性内体中的不对称分布。棒材=5µm。（C）入场后150分钟MLG分发。（D）使用蔡司LSM510软件3.2版的Profile函数测量了类似于图3所示的活细胞实验中发现的Tfn-TR内体（n=30内体）上的MLG“斑块”的大小，并绘制了其随时间变化的曲线图。

**图11。VSV进入和取消计数事件的时间线。**
基于rVSV-MLG中MLG和RNP的时空成像分析，建立了VSV进入和脱膜模型。分析中的相关数字显示在括号中。观察到的事件时间以红色字体显示。在该模型中，病毒粒子附着在细胞表面，以依赖Rab5的方式被内吞并运输到早期内体，低pH值会导致构象变化G，导致病毒粒子内部酸化（a），随后病毒膜和内体膜融合（B）。病毒内部酸化会影响M蛋白，破坏膜相关M（带橙色边界的绿色圆圈）和浓缩RNP之间的相互作用，导致RNP在膜融合（C）后释放到细胞质中。M的大部分仍然与内胚体相关，但在RNP释放（D）后开始扩散到内胚体膜。较小部分的M释放到胞浆中，以微管和肌动蛋白非依赖性的方式到达NPC（E）。

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