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比较研究
.2010年12月；90(12):1770-81.
doi:10.1038/lipinvest.2010.132。 Epub 2010年7月19日。

永生肝内皮细胞：用于运动和血管生成研究的细胞培养模型

罗伯特·C·休伯特 1, 库马拉维鲁-贾加维鲁, Ann F Liebl公司, 黄炳清（Bing Q Huang）, 帕特里克·L·斯普林特, 尼古拉斯·F·拉鲁索, 劳尔·A·乌鲁西亚, 维杰伊·沙阿
附属公司
比较研究

永生肝内皮细胞：用于运动和血管生成研究的细胞培养模型

罗伯特·C·休伯特等。 实验室投资. 2010年12月.

摘要

肝窦内皮细胞（HSEC）是肝窦内有窗内皮细胞的一个独特亚群，由肝窦内的大多数内皮细胞组成。HSEC不仅在血液清除、血管张力和免疫方面发挥重要作用，而且还经历病理变化，导致纤维化、血管生成和门脉高压。由于原代细胞分离耗时，数量有限，并且通常缺乏病理性血管系统的特征，因此很少有细胞培养模型用于运动和血管生成的体外研究。本研究的目的是从HSEC中获得一种永生细胞系，该细胞系模拟病理性血管系统，并允许进行详细的分子干预。用基于CD31的免疫磁珠分离法从小鼠肝脏分离HSEC，用SV40大T抗原永生化，并根据其内吞乙酰化低密度脂蛋白（AcLDL）的能力进行亚克隆。由此产生的细胞系，转化的窦状内皮细胞（TSEC），保持了内皮表型以及一些HSEC特异性特征。内皮细胞的典型显微特征证明了这一点，包括跛足足和丝状足的形成，以及细胞单层的鹅卵石状形态。电子显微镜显示，筛板中的窗孔数量有限。经PCR阵列、免疫印迹和免疫荧光（IF）检测，TSEC表达多种内皮特异性标记物，包括CD31和血管性血友病因子（vWF）。在功能上，TSEC保持着许多关键的内皮特征，包括血管生成因子的迁移、血管管的形成、AcLDL的内吞和细胞外基质的重塑。它们的表型与慢性肝病相关的病理新生血管最为相似，细胞增殖、防御和血管生成。重要的是，细胞可以用病毒载体高效转导。TSEC应为与广泛的肝内皮细胞功能相关的高通量体外研究提供可重复的细胞培养模型，但也可能提供更广泛的内皮细胞生物学。

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数字

图1
图1。隔离和永生化方案
通过机械破碎、酶消化和基于CD31的免疫磁性分离从小鼠肝脏分离HSEC。用SV40大T抗原永生化HSEC，并根据其内吞AcLDL的能力进行亚克隆。
图2
图2。文化特征与形态
A.标准RT-PCR证明SV40大T抗原在TSEC中表达，但在mHSEC中不表达。B.使用非放射性分析法在48小时内测量的增殖率显示了TSEC细胞系的快速生长特征。C.单个细胞的高倍相差显微镜图像显示mHSEC、TSEC和BAEC（63X）中的跛足和丝状足形成。D.汇流处的低倍图像显示TSEC的典型“鹅卵石”形态，类似于mHSEC和BAEC（20X）。
图3
图3。TSEC维护有限的筛板窗
A-B.用溅射涂层扫描电子显微镜显示，在（A）3500X或（B）30000X下观察到的mHSEC具有许多窗孔（箭头）。扫描电镜显示，在（C）3500X或（D）30000X下观察到的BAEC没有窗孔。E-H.扫描电子显微镜显示，TSEC在100至150 nm之间保持有限数量的窗孔，以筛板组织（箭头所示）。面板代表：（E）3500X溅射涂层，（F）30000X溅射涂料，（G）20000X碳涂层，（H）50000X碳涂层。
图4
图4。TSEC保持内皮细胞基因特征
A.TSEC保持与mHSEC类似的mRNA表达谱，通过SA Biosciences内皮细胞生物学通路特异性定量PCR阵列实时定量RTPCR进行评估。散点图显示了具有类似表达水平（黑线内）、上调（红色）或下调（绿色）B的基因数量。与mHSEC相比，热映射表示TSEC中表达的折叠变化。另请参见补充图1、2和3，分别了解具有折叠变化值、CT范围和通路分析的基因名称。
图5
图5。TSEC维持HSEC特异性标记物和内吞能力
A.代表性免疫印迹（50μg/lane）表明，与mHSEC相比，TSEC维持vWF、CD31和Caveolin-1的表达。B.IF染色证实了均匀表达，并显示了vWF、CD31和Caveolin-1（红色）的细胞质和质膜分布，核反染（蓝色）。C.与mHSEC相比，根据描述和荧光共焦显微镜成像进行了细胞内吞试验，以证明TSEC保持对Di-I标记的AcLDL颗粒的内吞能力。
图6
图6。趋化作用对血管生成生长因子的反应
A.TSEC在存在或不存在30 ng/ml VEGF或25 ng/ml FGF的情况下进行趋化性试验。迁移的细胞用DAPI染色。在存在或不存在30 ng/ml VEGF或25 ng/ml FGF的情况下，对B.mHSEC、BAEC和TSEC进行趋化性分析。迁移的细胞用DAPI染色（蓝色），并用Metamorph软件定量（n=7；平均+/-SE）。*通过Student T检验，与基础测试相比，P<0.05。#经Mann-Whitney U检验，与基础值相比P<0.05。
图7
图7。基质上的血管管形成
A.在存在或不存在30 ng/ml VEGF或25 ng/ml FGF的情况下，对TSEC进行还原生长因子Matrigel的血管形成试验。使用标准光学显微镜对血管管结构进行成像，并使用Metamorph软件进行量化（n=5；平均+/-SE）。*与基础组相比P＜0.05。B.BAEC和TSEC在完整的Matrigel上进行血管形成试验。使用标准光学显微镜对血管管结构进行成像，并使用Metamorph软件进行量化（n=5；平均+/-SE）。#经Tukey后验方差分析，与基础组相比P<0.05。*学生T检验与BAEC相比P<0.05。
图8
图8。转染和转导效率
A-C。相位对比和荧光显微镜的代表性叠加图像显示了TSEC通过基于脂质的转染（A）、腺病毒转染（B）或逆转录病毒转导（C）对GFP的转染和转导效率。D.使用脂质转染、腺病毒转导或逆转录病毒转导（n=6；平均+/-SE）量化TSEC中GFP的转染和转导效率。
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