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.2010年9月17日；285(38):29599-607.
doi:10.1074/jbc。M110.113670。 Epub 2010年7月8日。

Atg3中自噬相关蛋白8（Atg8）家族相互作用基序介导Atg3-Atg8相互作用，并对胞浆-空泡靶向途径至关重要

山口正矢 1, 野田信夫, 中川贤治, Kumeta宏之, Ohsumi吉诺里, 稻崎富彦
附属公司

Atg3中自噬相关蛋白8（Atg8）家族相互作用基序介导Atg3-Atg8相互作用，并对胞浆-空泡靶向途径至关重要

山口正也等。 生物化学杂志. .

摘要

自噬相关蛋白8（Atg8）结合系统对于在自噬过程中形成称为自噬体的双膜囊泡至关重要，自噬是大多数真核生物中保守的一个整体降解过程。在细胞质-空泡靶向（Cvt）途径中，酵母通过受体蛋白Atg19识别靶空泡酶也很重要，这是一种选择性的自噬。Atg3是一种类E2酶，将Atg8与磷脂酰乙醇胺结合。这里，我们证明了Atg3通过WEDL序列直接与Atg8相互作用，这与E2和类泛素修饰语之间的典型相互作用不同。此外，核磁共振实验表明，Atg8和Atg3之间的相互作用模式与Atg8/LC3和自噬受体（如Atg19和p62）中保守的Atg8家族相互作用基序（AIM）之间的模式非常相似。因此，Atg3中的WEDL序列是一个规范的AIM。体外分析表明，Atg3 AIM对Atg8从Atg8～Atg3硫代酯中间体转移到磷脂酰乙醇胺至关重要，但对中间体的形成不起作用。有趣的是，体内实验表明，这对Cvt途径是必要的，但对饥饿诱导的自噬不是必要的。Atg3 AIM在体外减弱了Atg19对Atg8脂质过氧化的抑制作用，表明Atg3 AIM可能在Cvt途径中对Atg19结合的Atg8的脂质过氧化起重要作用。

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数字

图1。
图1。
Atg3 HR的WEDL序列负责Atg8-Atg3交互。 A类显示了酵母Atg3同源物之间Atg3-HR的多序列比对。星号,结肠、和周期分别表示完全、高度和适度保守的残基。WEDL序列由正方形。Sc公司,酿酒酵母;Kl公司,乳克鲁维酵母;银,棉蚜Ashbya gossypii;Pp（磅/平方英寸）,毕赤酵母B，一个在体外显示GST融合的Atg3s和Atg8之间的下拉分析。C类,15用非标记Atg8 K26P滴定N标记的Atg3 HR至1.5摩尔当量，并使用方程Δppm=[（ΔδHN）计算化学位移扰动（Δppm）2+（ΔδN/5）2]1/2Trp的主链270，谷氨酸271，天冬氨酸272、和Leu273是彩色的红色其他HR残留物的残留物被着色灰色.Trp侧链270是彩色的青色。天,1H、，15显示Atg3 HR的N稳态NOE。颜色与中相同C类.
图2。
图2。
Atg8-Atg3目标交互类似于Atg8-Atg19目标互动。 A类，进行了Atg8和Atg3HR之间的化学位移微扰实验。[15N] 使用未标记的Atg3 HR滴定Atg8 K26P，直至1.5摩尔当量，并使用Δppm=[（ΔδHN）计算化学位移扰动（Δppm）2+（ΔδN/5）2]1/2.Δppm值高的残留物被着色红色（>0.4）和黄色的（>0.2），分别映射到Atg8-Atg19的结构上目标复合物（PDB ID 2ZPN），其中Atg19肽以棒状模型显示。叠加的七个HSQC光谱如所示补充图S2.B类图中显示了Atg8和全长Atg3之间转移交叉饱和实验中交叉峰的强度比。强度比计算为sat（+）/sat（−）。Thr的比率4，苯丙氨酸5，赖氨酸6，氩气47，天冬氨酸102和Phe104不可用。低强度比的残基映射在Atg8-Atg19的结构上目标复合体，其中强度比低于0.5、0.6和0.7的着色红色,橙色、和黄色的分别是。C类，一个在体外显示GST融合的Atg3和Atg8突变体之间的下拉分析。
图3。
图3。
附件8-附件3目标相互作用是形成Atg8-PE共轭物的原因在体外. A类纯化的Atg3s、Atg7和Atg8在303 K下与ATP孵育15分钟。然后，用NuPAGE分离样品，不还原，并用CBB染色检测Atg8～Atg3硫代酯中间产物。B类，将纯化的Atg3s、Atg7、Atg8和含有PE的脂质体与ATP在303K下孵育1小时。然后通过尿素SDS PAGE分离样品，并通过CBB染色检测Atg8 PE。C类、Atg8和Atg8-PE带在60分钟B类定量，并通过将Atg8-PE量除以Atg8总量来计算共轭形成。这个值和误差线分别是三个独立实验的平均值和S.D。
图4。
图4。
附件8-附件3目标在存在Atg12-Atg5共轭物的情况下，相互作用对Atg8脂质化是不必要的。 A类、Atg3突变蛋白的表达水平和Atg8的脂质化体内如图所示。自动变速器组3携带表达野生型Atg3着丝粒质粒的Δ酵母细胞(重量)或其突变形式(W270A型)或者将空向量增长到中对数阶段(营养丰富)然后在缺氮培养基中孵育4.5小时(饥饿). 蛋白质通过碱性处理提取，并通过SDS-PAGE分离，然后用抗Atg3和Atg8抗体进行免疫印迹。B类将纯化的Atg3s、Atg7、Atg8和含PE的脂质体与ATP在303 K温度下孵育1 h，添加或不添加0.2μ米附件12-附件5-附件16N。样品用尿素-SDS-PAGE分离并用CBB染色检测。
图5。
图5。
附件8-附件3目标相互作用对Cvt途径至关重要，但对饥饿诱导的自噬不重要。 A类，碱性磷酸酶(碱性磷酸酶)显示了Atg3突变体的检测结果。野生型Atg3和W270A突变体在碱性磷酸酶检测的指示菌株中从着丝粒质粒中表达，并在富含营养（饥饿0 h）和饥饿（4.5 h）条件下测量其自噬活性。实验重复了三次，结果的平均值显示为误差线对于S.D。B类图中显示了Atg3突变体中的Cvt途径。如图4所示，通过用抗Ape1的免疫印迹检测在富含营养的条件下表达野生型Atg3或W270A突变体的酵母细胞中Ape1的成熟A类。对Ape1的前体和成熟形式的带进行量化，以计算成熟效率，三个独立实验获得的平均值如下所示误差线对于S.D。C类，显示Ams1的活性测定。在Ficoll阶跃梯度上分离液泡，并按照“实验程序”中的描述测量Ams1活性。通过将液泡部分中恢复的总酶活性除以梯度上加载的总活性来计算回收率，以获得液泡部分。实验重复了三次，结果的平均值显示为误差线对于S.D。
图6。
图6。
附件3目标在存在Atg19的情况下，高效的Atg8脂质氧化需要。 A类，一个在体外在存在不同数量野生型Atg3的情况下，GST融合的Atg19和Atg8之间的下拉试验(左边)或Atg3 W270A(正确的)如图所示。等价物价值面板上方平均Atg3与GST-Atg19的摩尔比。B类将纯化的Atg3s、Atg7和Atg8在303 K的温度下在50μ米Atg19.对样品进行NuPAGE，然后进行免疫印迹(IB公司)使用抗Atg8抗体。C类将纯化的Atg3s、Atg7、Atg8和含PE的脂质体与ATP在303 K、0～10μ米Atg19。然后对样品进行尿素-SDS-PAGE，并通过CBB染色检测蛋白带。天、Atg8和Atg8-PE带在1小时内C类并通过将Atg8-PE量除以Atg8总量来计算共轭形成。值和误差线分别是三个独立实验的平均值和S.D。
图7。
图7。
Atg3的建议模型目标在Cvt通路中发挥作用。在细胞溶质中翻译后，前体Ape1自我组装成一个巨大的复合物(Ape1复合体; 灰色）和Atg19(青色)和附件8(绿色)通过直接前体Ape1-Atg19和Atg19包覆复合物目标-Atg8交互。Atg7激活Atg8后(红色)，附件8-附件19目标交互被Atg8-Atg3取代目标在未知来源的膜中，Atg8与PE偶联，这可能在扩大Ape1复合体附近的隔离膜方面起到关键作用。
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    1. Scott S.V.、Baba M.、Ohsumi Y.、Klonsky D.J.（1997）《细胞生物学杂志》。138, 37–44-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Baba M.、Takeshige K.、Baba N.、Ohsumi Y.（1994）《细胞生物学杂志》。124, 903–913-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Nakatogawa H.、Suzuki K.、Kamada Y.、Ohsumi Y.（2009）《分子细胞生物学自然评论》。10, 458–467-公共医学

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