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.2010年6月；160(4):941-57.
doi:10.1111/j.1476-5381.2010.00704.x。

一种基于单溴双歧杆菌的测定血液中活性硫化物药物动力学特征的方法

爱德华·温特纳 1, 托马斯·戴克沃思, 威廉·兰斯顿, 阿萨·本特森, 迪娜·莱维滕, 保罗·希尔, 迈克尔·A·因斯科, 罗纳德·迪米特, 艾米丽·范登埃卡特, 克里斯托弗·F·图姆斯, 萨巴·萨博
附属公司

一种基于单溴双歧杆菌的测定血液中活性硫化物药物动力学特征的方法

爱德华·温特纳等。 杂志. 2010年6月.

摘要

背景和目的：硫化氢（H（2）S）是半胱氨酸的一种不稳定的内源性代谢产物，具有多种生物作用。量化血液和组织中H（2）S的可靠方法将有助于开发以硫化物为基础的人类疾病治疗方法。

实验方法：通过与硫代特异性衍生剂单溴二苯醚反应，然后采用反相荧光HPLC和/或质谱法，对生理盐水和新鲜抽取的全血中的活性硫化物浓度进行定量。在药代动力学研究中，雄性大鼠接受静脉注射硫化钠或吸入硫化氢气体，并测量可用的血液硫化物水平。同时使用安培传感器测量溶解H（2）S/HS（-）的水平。

主要成果：研究发现，一溴联苯胺可以在盐水或全血中快速定量地衍生硫化物，从而产生稳定的小分子硫化物二亚胺。通过反相高效液相色谱分离结合荧光检测以及质谱法验证了这种双比曼衍生物的提取和定量。血液中硫化物的基线水平在0.4-0.9微米之间。静脉注射硫化钠溶液（2-20 mg x kg（-1）x h（-1））或吸入h（2）S气体（50-400 ppm）以剂量依赖性方式升高血液中的活性硫化物。每向大鼠输注1 mg x kg（-1）x h（-1）的硫化钠，其药代动力学相当于吸入约30 ppm的h（2）S气体。

结论和影响：单溴二苯醚衍生化法是测定全血中活性硫化物的一种灵敏可靠的方法。使用这种方法，我们建立了注入硫化钠和吸入硫化氢气体之间的生物等效性。

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数字

图2
图2
一溴二苯醚衍生物和乙酸乙酯提取血液样品的典型色谱图。（A） 荧光示踪（λ前任=390纳米，λ相对长度单位=475 nm），根据幼年大鼠血液（实线）和补充有5µM硫化物（虚线）（SdB，硫化物二比曼；mBrBim，单溴二比曼）的大鼠血液分析得出。（B） 吸光度迹线（λ防抱死制动系统=254 nm）。样品中的硫化物浓度是根据硫化物二比曼（SdB）峰下12.1分钟的荧光面积计算得出的。（C）HPLC色谱图的荧光面积与硫化物二比曼浓度之间的线性响应关系，在乙腈中注入7µL标准硫化物二比明溶液。乙腈中硫化物二比曼溶液的比荧光为2.77 FAU·pmol−1硫化物二比曼。
图1
图1
硫化物与单溴双环芳烃衍生形成硫化物二比曼的反应方案。
图3
图3
一溴双马烷反应动力学分析。在乙腈/HEPES缓冲液中，将浓度在3µM至100µM之间的硫化物与1 mM一溴比曼反应，随后形成硫化物二亚胺，随后产生荧光（λ前任=390 nm，λ相对长度单位=475 nm）。反应是相对于底物硫化氢的一级反应，具有速率常数k个=0.01±0.0016秒−1根据硫化物二比曼标准校准荧光，硫化物与过量的一溴二比曼完全反应。数据显示了三个独立实验的代表性曲线。
图4
图4
从大鼠全血中回收硫化物二亚胺作为硫化物二亚胺浓度的函数。用硫化物二比曼补充重复血样，按照上述规定通过乙酸乙酯萃取进行处理，然后通过HPLC进行分析。该试验中硫化物二比曼的平均回收率为76%，且该回收率与硫化物二比明的浓度无关。白色和黑色条显示来自两个独立实验的数据。
图5
图5
硫化物的主要氧化产物不干扰硫化物的定量。在存在生理浓度的（A）亚硫酸盐（SO）的情况下，用一溴二苯醚衍生添加了硫化钠的对照大鼠血液或大鼠血液三2–)，（B）硫酸盐（SO42−)和（C）硫代硫酸盐（S2哦三2−). 在高达10µM亚硫酸盐、1200µM硫酸盐和90µM硫代硫酸盐的情况下，未观察到对测量的硫化物水平的影响。数据表示三个重复的平均值±SEM。
图6
图6
在大鼠单次静脉注射硫化钠后测量血液中的硫化物水平。剂量为1 mg·kg−1硫化钠在1min时可引起血中硫化物水平的短暂升高，而剂量为4mg·kg−1硫化物在注射后30分钟内产生上升，计算的半衰期约为5.7分钟。数据表示n个=每个时间点4只动物。
图8
图8
大鼠吸入h后2h内单溴二苯醚反应性血硫化物水平的相关性2S气体或不断注入硫化钠溶液。图是图7A和B所示2 h数据的重新绘制，显示为平均值±SD；n个=每组3人。
图7
图7
（A） 大鼠连续静脉注射硫化钠溶液（2、5、10或20 mg·kg）后的血液硫化物水平−1·小时−1). （B） 大鼠暴露于含有不同浓度H的空气后的血液硫化物水平2S气体（50、100、200、300、400 ppm）。数据表示平均值±SD；n个=每组3人。输液和吸入实验的暴露时间均为2小时。
图9
图9
（A） 将10µM硫化钠添加到耗氧缓冲盐水溶液中后，比较电流传感器和基于单溴双环芳烃的硫化物测量。数据代表的平均值±SDn个=3次重复。（B） 在向人体血液中添加20µM硫化钠后，比较电流传感器和基于单溴二苯醚的硫化物测量。（C） 向人体血浆中添加20µM硫化钠后，比较电流传感器和基于单溴二苯醚的硫化物测量。（D） 在50 mM HEPES和155 mM NaCl中向含有5%人血清白蛋白的溶液中添加20µM硫化钠后，比较电流传感器和基于单溴二苯醚的硫化物测量。数据表示三个重复的平均值±SD。
图10
图10
大鼠静脉注射1mg·kg后腔静脉硫化物的测定−1硫化钠超过10、20、30或60秒，并检测溶解氢2S使用电流传感器。数据表示平均值±SEM；n个= 3.
图11
图11
体内以10、20和60mg·kg速率逐步升高硫化钠输注大鼠时基于电流传感器和单溴二苯醚（mBrBimane）的血硫化物测量的比较−1·小时−1，每个5分钟。数据表示平均值±SEM；n个= 3.
图12
图12
通过一溴联苯胺的衍生化进行测量34硫硫化物和32给药期间大鼠血液中的S-硫化物34S-硫化钠。大鼠连续静脉注射34硫硫化物在10 mg·kg条件下超过120 min−1·小时−1.血液浓度34S-硫化物呈剂量依赖性增加，而32硫硫化物血液浓度保持不变。数据表示平均值±SEM；n个= 8–10.
图13
图13
大鼠静脉团注3mg·kg后静脉血中有效硫化物的浓度−1硫化钠，通过单溴双马烷分析在微量透析液中测定。通过非线性回归分析峰值后的值并拟合曲线（粗红线），得出22 s的半衰期。所示数据为平均值±SEM；n个= 4.
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