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.2010年8月15日；316(14):2322-39.
doi:10.1016/j.yexcr.2010.05.020。 Epub 2010年5月24日。

Syndecan-1调节细胞迁移和纤维连接蛋白原纤维组装

玛丽·安·斯特普 1, 威廉·P·戴利, 奥黛丽·伯恩斯坦, 索纳利·帕尔·戈什, 高利·塔德瓦尔卡, 阿列克谢·沙舒林, 莎拉·帕尔森, 罗莎琳·朱尔斯, 梅琳达·拉森
附属公司

Syndecan-1调节细胞迁移和纤维连接蛋白原纤维组装

玛丽·安·斯特普等人。 Exp单元Res. .

摘要

角膜瘢痕是世界范围内失明的主要原因，可能是由于胶原纤维沉积量异常，缺乏形成透明角膜所需的正确大小和间距。胶原纤维的形成需要预先形成的纤维连接蛋白（FN）基质。我们证明角膜基质细胞（CSC）中syndecan1（sdc1）的丢失会影响细胞迁移率、病灶和纤维粘连的大小和组成、整合素的激活以及纤维连连接蛋白组装成纤维。整合素和纤连蛋白在sdc1缺失的CSC上的表达没有改变。使用低浓度与高浓度FN和I型胶原（CNI）或玻璃体凝集素（VN）进行的细胞粘附、扩散和迁移研究表明，sdc1缺失对整合素激活的影响取决于所评估的整合素介导的活性。添加氯化锰可逆转sdc1-null CSC中FN纤维生成和迁移的差异，但细胞扩散差异仍然存在。为了确定我们对sdc1的发现是否对角膜有特异性，我们比较了sdc1-null真皮成纤维细胞和CSC的表型。我们发现，如果没有sdc1，两种细胞类型的迁移速度都更快；然而，这两种细胞类型在FN表达及其组装成纤维方面存在细胞类型特异性差异。总之，我们的数据表明，sdc1在多种细胞类型中起调节整合素活性的作用。sdc1介导的整合素功能的丧失导致基质组装中细胞类型的特异性差异。更好地了解不同细胞类型如何通过合成癸烷和整合素调节FN原纤维的形成，将有助于更好地治疗瘢痕形成和纤维化。

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数字

图1
图1。sdc1-on在体内外角膜基质成纤维细胞上的表达
答：。在wt小鼠角膜清创24小时和48小时后，可在后角膜CSC中检测到sdc1和FN的表达。星号表示以下面板中显示的区域放大了三倍，最后一行面板中没有显示初级抗体阴性对照。请注意，虽然如箭头所示，sdc1存在于一些细胞内，但也可以在胶原板层之间的基质内观察到。细胞外sdc1是由于sdc1外结构域脱落引起的，可能来源于上皮细胞或基质细胞。B。在培养后的第二天和第五天，Sdc1在wt-CSC亚群中表达。从wt和sdc1阴性小鼠分离的所有细胞均为波形蛋白阳性，并组装了无法区分的含波形蛋白的中间丝网络。C、。对从wt和sdc1缺失的CSCs中分离的mRNA进行定量RT-PCR，以确认sdc1在缺失细胞上不存在，并寻找通过上调sdc2、sdc3和sdc4来补偿sdc1丢失的证据。数据表明，sdc1用wt表示，而不是sdc1空CSC；sdc2、sdc3和sdc4在两种基因型的细胞中表达水平相似。条形图英寸A类和B类等于20µm。
图2
图2。Sdc1空CSC迁移速度比wt细胞快，但表达类似水平的整合素
A.进行了时间推移显微镜研究，在16小时40分钟的时间段内研究的10个代表性细胞的轨迹用红色表示。sdc1空细胞的轨迹比wt细胞的轨迹长。B.计算在10%血清和规定的角质细胞培养基中孵育的细胞的细胞速度，该培养基使细胞保持静止状态。C.免疫印迹用于定量wt和sdc1缺失CSCs中的整合素和αSMA。肌动蛋白被用作负荷控制，以计算所示每个蛋白质的相对表达。尽管αv、α5和β1整合素以及αSMA的表达有增加的趋势，但数据没有显著差异。D.流式细胞术用于评估表面整合素的表达。β1或αv整合素在wt或sdc1缺失的CSC上的表达没有差异。填充曲线表示使用对照IgG测定的荧光强度，开放曲线表示所示整合素的数据。
图3
图3。与wt细胞相比，Sdc1缺失的CSCs组装含有β1和αv整合素的局灶性黏附，β3和α5较少
A类和B类显示wt和sdc1空白细胞在培养基中生长两天，固定、渗透并分别对vinculin、αv和β1整合素进行免疫染色，或对vincullin、α5和β3整合素分别进行免疫染色。在每张图像中识别出一个星号的感兴趣区域被数字放大三倍，呈现出三个单独染色并合并的分子。请注意，在wt和sdc1缺失细胞中，β1和αv整合素共同定位在局灶性粘连内，并且这些相同的含有长春新碱的局灶性粘连几乎没有显示出β3和α5整合素的证据。在Image Pro Plus中使用了线工具，并确定了αv和β1整合素与长春新碱的比率；此外，wt和sdc1空细胞中含有vinculin的簇的平均强度（以像素为单位）。每个变量至少评估10个细胞，每个细胞计算不少于100个比率。数据显示了wt和sdc1空细胞中的外周粘附。C类使用β1、β3、α5或αv整合素抗体对wt和CSC提取物进行免疫沉淀，然后用αv整合素进行免疫印迹，以揭示CSC提取物中存在αvβ1整合素异二聚体。αv是使用抗β1、β3和αv整合素的抗体而非α5的抗体进行免疫沉淀的（红色箭头）。A中条形图中的星号表示通过方差分析得出的显著数据，p值<0.05，A和B中的条形图=10µm。
图4
图4。CSCs与二价阳离子的整合素激活导致细胞外基质依赖性差异，导致sdc1阴性细胞粘附和扩散，但减少wt和sdc1阳性细胞之间的细胞迁移差异
答：。CSC粘附在无涂层、FNCN1-或VN-coated（有或无MnCl）上1小时2测定处理和附着细胞的数量。B.和C。CSC粘附在无涂层、FNCN1或VN涂层表面20分钟，并补充或不补充MnCl的培养基2细胞扩散4小时。氯化锰2-诱导整合素活化指数（MnCl扩散面积2每个变量至少计算80个细胞的处理/未处理细胞的铺展面积，并在MnCl条形图上方显示2-面板中处理过的细胞B类; 面板内C类免疫染色显示肌动蛋白丝（绿色）和维丘里蛋白（红色）可识别未涂层表面上细胞的局部粘附。注意MnCl的较大尺寸2-与wt细胞相比，处理过的sdc1空细胞及其较大的局灶性粘附。D。时间推移显微镜研究表明，当分别将sdc1缺失细胞移植到未涂层的组织培养塑料、FNCN1或VN上时，其迁移速度快于wt细胞；下图显示了未经处理的sdc1-null与wt细胞迁移率的倍数差异。当MnCl2添加到培养物中，sdc1-null CSC迁移率降低，使得两种基因型迁移率相同。图表右侧的数据显示了MnCl引起的速度的倍数变化2对每种测试的基质进行处理。星号表示AVOVA具有统计意义的数据。比例尺如所示C类=20µm。
图5
图5。缺乏sdc1的CSC表达活性较低的β1整合素阳性纤维和局灶性粘连
CSC隔夜培养，然后用氯化锰处理224小时。细胞固定并进行免疫染色，不使用任何一种（A）激活依赖性β1整合素抗体9EG7和功能阻断性β1整合素抗体Ha2/5或(B类)FITC-偶联9EG7活化依赖性β1整合素抗体和生物素化功能阻断αv抗体RMV-7。DAPI用于显示细胞核。左侧每张图像中由白色星号表示的感兴趣区域被数字放大为原始大小的三倍。整合素在右侧单独显示并合并。B中的箭头突出显示激活的β1整合素和αv整合素均为阳性的簇；箭头表示活化的β1整合素呈阳性簇，但αv整合素不呈阳性簇。所示对照为A类以及与之无关的FITC-结合IgG和Alexa 594-结合链霉亲和素B类图中所示A类，使用9EG7获得的活化β1整合素与使用Ha2/5获得的β1整合素的比率，以及B类，使用9EG7获得的活化β1整合素与使用RMV-7获得的αv整合素的比率。每个变量至少评估10个细胞，每个细胞计算不少于100个比率。图表上的黑色星号表示ANOVA显著的数据，p<0.05。A和B中的比例尺等于10µm。
图6
图6。缺乏sdc1的CSC合成相同数量的FN，但组装较少的DOC不溶性FN纤维
答：。野生型和sdc1-null CSC培养五天，并用内源性FN特异性抗体进行免疫染色。与野生型对应物相比，Sdc1-null CSC表现出更少的内源性FN原纤维（绿色）。F-actin（指骨样蛋白，红色）和细胞核（DAPI）染色也显示出来。B。与野生型CSCs相比，Sdc1空CSCs的DOC可溶性FN增加，DOC不溶性FN减少。CSC DOC可溶性和不溶性提取物的定量分别归一化为β-肌动蛋白和波形蛋白水平，并相对于野生型CSC进行表达。波形蛋白（DOC不溶性）和β-肌动蛋白（DOC-溶性）证实了两个组分的分离。相反，野生型和sdc1-null CSC在总内源性FN的数量上没有差异，量化标准化为GAPDH。所示为三个典型实验中的一个。C、。Sdc1空CSC还将较少的外源性FN并入纤维基质（红色），显示为相对于内源性基质（绿色）。对于顶部图像，A中的比例尺为100µm，对于下部图像，比例尺为40µm；在C中，棒为20µm。Wt和sdc1空单元格以相同的放大倍数显示。
图7
图7。氯化锰2sdc1阴性细胞的治疗使FN纤维生成表型恢复为wt细胞的表型
答：。野生型和sdc1缺失的CSCs用增加浓度的MnCl处理2然后对内源性FN进行免疫染色。氯化镁2用作阴性对照。在MnCl存在下，两种基因型都聚集了数量增加的内源性FN原纤维（绿色）2，但不包括氯化镁2。使用DAPI检测到的Nuclei以蓝色显示。B。从（A）中所示实验的至少五张代表性图像中，对归一化为核染色的FN像素总强度进行量化，结果表明，MnCl浓度的增加2，但不包括氯化镁2，将sdc1缺失CSC的FN纤维生成表型恢复为野生型细胞。C、。在MnCl存在和不存在的情况下培养的野生型和sdc1-null CSC的DOC提取物2发现野生型和sdc1缺失细胞在与MnCl培养时均表现出DOC-可溶性FN数量减少和DOC-不溶FN数量增加2但这种效应对于sdc1空细胞更为明显。如图5B所示进行定量，并使用β-肌动蛋白（DOC可溶性）和波形蛋白（DOC-不溶性）评估分离质量。D。增加MnCl浓度培养的Sdc1空CSC2将培养期间外源性添加到细胞中的类似数量的荧光FN加入到纤维基质中，作为其野生型对应物。荧光FN（红色）相对于总FN（绿色）显示。方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，N=5。标尺，20µm（A、D和E）。
图8
图8。缺乏sdc1的皮肤成纤维细胞合成增加的FN水平并聚集DOC不溶性FN纤维
答：。对野生型和sdc阴性皮肤成纤维细胞进行总FN（绿色）免疫染色；肌动蛋白（红色）和细胞核（蓝色）分别用罗丹明指骨肽和DAPI显示。野生型和sdc1缺失的真皮细胞在细胞表面聚集FN纤维。B。与野生型皮肤成纤维细胞相比，Sdc1缺失皮肤成纤维母细胞显示DOC-可溶性和不溶性FN增加。Sdc1缺失皮肤成纤维细胞也比野生型成纤维细胞表达更多的总FN。定量表达与肌动蛋白和野生型皮肤成纤维细胞有关。所示为每个实验的代表性印迹和该印迹的量化。比例尺，40µm和20µm（A）。
图9
图9。CSC中sdc1如何调节整合素激活和FN纤维生成的拟议模型
A类示意性地显示了我们假设的sdc1在调节整合素激活中所起的作用。我们认为，sdc1直接或间接促进整合素的激活，从而使细胞迁移速度适中，FN纤维生成最佳。橙色方框显示在wt和sdc1空细胞中观察到的主要整合素激活状态。氯化锰2进一步激活整合素并增强FN原纤维的形成。由于整合素确实在sdc1阴性细胞的FA内聚集，因此sdc1阳性细胞中的α和β整合素细胞质域必须分离，以允许talin、vinculin和其他局部粘附支架蛋白结合和聚集。由内而外的整合素信号传导还涉及两个整合素细胞质尾部彼此远离的运动；它伴随着头部结构域的旋转和配体结合。在sdc1阴性细胞中，尽管存在聚集现象，但其局灶和纤维粘连内的整合素仍然不活跃，除非用氯化锰处理细胞2.B类表明MnCl2激活后，sdc1阴性细胞扩散更多，迁移速度较慢，在其表面积聚更多FN纤维。具有中间活性的整合素支持更快的迁移并减少FN纤颤。
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