Myocardin-related transcription factor-a controls myofibroblast activation and fibrosis in response to myocardial infarction

doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.223172

。2010年7月23日；107（2）：294-304。

doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.223172。 Epub 2010年6月17日。

心肌梗死时肌钙蛋白相关转录因子a控制肌成纤维细胞活化和纤维化

埃里克·M·斯莫尔¹, 杰弗里·撒切尔, 莉莲·B·萨瑟兰, Hideyuki Kinoshita先生, 罗伯特·D·杰拉德, 詹姆斯·理查德森, J迈克尔·迪马约, 赫沙姆·萨德克, 久原光一郎, 埃里克·N·奥尔森

附属公司

PMID： 20558820
预防性维修识别码： PMC2921870型
内政部： 10.1161/CIRCRESAHA.110.223172号

心肌梗死时肌钙蛋白相关转录因子a控制肌成纤维细胞活化和纤维化

埃里克·M·斯莫尔等人。循环研究。 2010。

。2010年7月23日；107(2):294-304.

doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.223172。 Epub 2010年6月17日。

作者

附属

¹美国德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系。

PMID： 20558820
预防性维修识别码： PMC2921870型
内政部： 10.1161/CIRCRESAHA.110.223172号

摘要

理论基础：心肌梗死（MI）导致心脏缺血区心肌细胞丢失，继而发生纤维化和瘢痕形成，从而降低心脏收缩力，阻碍血管生成和修复。肌成纤维细胞是一种从成纤维细胞样状态转变为收缩、平滑肌样状态的特殊细胞类型，被认为是受伤心脏和其他组织纤维化的主要原因，尽管纤维化和肌成纤维组织活化的转录介质尚不明确。肌球蛋白相关转录因子（MRTF）是促进平滑肌表型的血清反应因子（SRF）辅因子，是应激反应信号的组成部分。

目标：我们旨在研究MRTF-A对心脏重塑和纤维化的影响。

方法和结果：在这里，我们表明MRTF-A控制纤维化基因程序的表达，该程序包括参与细胞外基质生成和心脏平滑肌细胞分化的基因。在MRTF-A-null小鼠中，与野生型同窝鼠相比，MI或血管紧张素II治疗后的纤维化和瘢痕形成显著减轻。MRTF-A缺失的这种保护作用与纤维化相关基因的表达减少有关，包括胶原1a2，后者是SRF/MRTF-A的直接转录靶点。

结论：我们得出结论，MRTF-A通过调节肾素-血管紧张素系统和心肌梗死后重塑来调节肌成纤维细胞活化和纤维化。

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数字

**图1。MRTF-A缺失导致MI后瘢痕形成减少**
**（A）**心肌梗死后14天代表性心脏的整体图像和两个代表性心脏切片的Masson三色染色。箭头表示结扎点，剖面用水平线表示。Masson三色染色显示右心室右心室梗死区瘢痕缩小且更致密（对比a1和a2与b1和b2）；左心室。比例尺=1 mm。**（B）**梗死面积的量化以Masson三色染色阳性的左室面积百分比表示。n=8只体重和8只KO动物。**（C）**通过亚甲基蓝灌注确定危险区域（AAR）。AAR无染色。箭头表示左前降支上的结扎点。**（D）**AAR的量化表示为心肌梗死后10分钟和1天未染色LV质量的百分比。n=4 WT和4 MRTF-A^−/−动物在10 min、3 WT和3 MRTF-A时^−/−MI后1天的动物。**（E）**心肌梗死后1天，在每个心脏梗死区内至少4个独立的区域对TUNEL阳性细胞进行定量，并从2个WT和3个MRTF-A中取平均值^−/−动物。数据表示为TUNEL阳性Dapi染色细胞核的百分比。**（F）**心肌梗死后14天，在每个心脏BZ的至少7个独立区域内对磷酸化氢istone H3阳性细胞进行定量，并从3个WT和4个MRTF-A中取平均值^−/−动物。误差条表示SEM。

**图2。MRTF-A影响心肌梗死后14天ECM基因表达**
**（A）**实时PCR检测假心脏（S）和梗死边缘区（BZ）或远端（R）区域的各种ECM成分，显示MRTF-A的BZ胶原基因表达减弱^−/−红心。**（B）**细胞因子TGFβ-1、-2和-3在WT和MRTF-A之间的BZ表达无明显变化^−/−红心。**（C）**应激反应性ANF基因在MRTF-A中表达降低^−/−红心。WT和MRTF-A的BZ中的TnC水平升高到类似水平^−/−动物。n=4 WT和4 MRTF-A^−/−心脏梗死组和2个shams。误差条代表SEM。

**图3。MRTF-A缺失导致心肌梗死后14天平滑肌基因表达改变**
**（A）**实时PCR显示在MRTF-a的BZ和远端区域SM22和SMA诱导显著减少^−/−心脏（*表示p值<0.01，†表示p值<0.05）。n=4 WT和4 MRTF-A^−/−每个梗死组和2个假手术组的心脏数。**（B）**WT和MRTF-A心脏组织切片^−/−显示心肌梗死后14天的小鼠。与用于免疫组织化学的心脏相邻的代表性心脏的H&E染色（a，b）切片显示了缺血性损伤，并突出了梗死的BZ。（a’和b’）a和b中装箱区域的放大。（a“和b”）对应于代表性WT和MRTF-a装箱区域的SMA免疫染色^−/−梗死的心脏。箭头标记SMA阳性纺锤形肌成纤维细胞。a的比例尺，b=1mm。a'、a“和b'、b”的比例尺=40μm。**（C）**每个视野中SMA阳性肌成纤维细胞的数量。**（D）**每个视野BZ内SMA阳性小动脉的数量。n=3 WT和3 MRTF-A^−/−红心。误差线代表SEM。在每个心脏BZ内至少3个视野放大40倍进行量化，并取3个WT和3个MRTF-A的平均值^−/−心脏（*表示p值<0.05）。误差条代表SEM。

**图4。MRTF-A缺失减轻慢性AngII给药后的纤维化**
**（A）**WT（a，b）或MRTF-a给药14天后，对代表性组织切片进行Masson三色染色^−/−（c，d）小鼠。**（B）**左心室三色染色定量。误差条代表SEM（*表示p值<0.05）。**（C）**胶原基因和平滑肌分化标记物的定量RT-PCR显示AngII给予MRTF-A后Col1a、Col3a、SMA和SM22的诱导减弱^−/−动物。误差条代表SEM（*表示p值<0.05）。

**图5。MRTF-A调节CF平滑肌标志物的表达**
**（A）**定量实时PCR显示心肌蛋白仅在CMC中表达，而MRTF-A在CMC和CF中的表达水平相似。**（B）**定量实时RT-PCR显示，相对于β-半乳糖感染的对照CF，SMA和SM22在过度表达MRTF-A的CF中显著富集。误差条代表SEM。**（C）**CFs的间接免疫荧光显示，MRTF-A过度表达导致SMA富集成组织应激纤维，而Ad-β-gal感染的CFs主要表现为皮质肌动蛋白SMA染色。比例尺=25μm。

**图6。TGFβ-1和ROCK抑制剂Y-27632对CFs中MRTF-A核定位和活性的调节**
**（A）**在无血清（SF）培养基或补充TGFβ-1（10ng/ml）、Y-27632（10μM）或TGFβ-1和Y-27632。使用相同的曝光设置拍摄所有图像。比例尺=25μm。**（B）**CFs在SF培养基或补充TGFβ-1、Y-27632或TGFβ-1和Y-27633的培养基中生长24小时后，对标记的MRTF-A进行免疫细胞化学检测。比例尺=100μm。**（C）**不同培养条件下Flag-MRTF-A亚细胞定位的量化。对每种情况下大约20个随机视野对Flag-MRTF-A的亚细胞定位进行评分。误差线代表SEM（*表示p值<0.01；†表示p值<0.05）。

**图7。MRTF-A调节Col1a2表达**
**（A）**[^三H] CFs中的脯氨酸掺入表明MRTF-A显著丰富胶原蛋白合成。CFs血清饥饿48小时，然后感染10 MOI Ad-MRTF-A或Ad-β-gal，并在SF培养基或补充2.5%FBS、TGFβ-1（10 ng/ml）、Y-27632（10μM）或TGFβ-1和Y-27631的培养基中培养48小时。误差条代表SEM。**（B）**定量实时RT-PCR显示用空载体对照或MRTF-A表达载体转染的10T1/2细胞中Col1a2、Col3a1、SMA和SM22的表达。**（C）**显示了瞬时转染分析和EMSA中使用的区域的描述。蓝色峰值表示哺乳动物调控序列的进化保守性和一致性位于底部，突出了保守的CArG、SP1和Smad位点。EMSA和瞬时转染分析中使用的CArG突变与WT CArG一致。**（D）**使用针对内源性SRF的抗体对Col1a2或GAPDH启动子序列进行染色质免疫沉淀。针对PolII或IgG的抗体作为阳性和阴性对照。输入为总染色质的1%。**（E）**电泳迁移率分析表明SRF与保守的CArG盒结合。标记抗体超转移SRF/DNA复合物，而WT未标记的竞争物寡核苷酸消除转移的复合物。突变寡核苷酸（m）无法结合SRF，未标记的突变竞争物（m）未能消除SRF/CArG相互作用。**（F）**用WT或CArG突变体Col1a2-luciferase构建物瞬时转染COS细胞显示出对MRTF-a的剂量依赖性反应。误差条代表SD。**（G）**MRTF-A诱导瞬时转染CFs中Col1a2-luc的表达，并在10%FBS的存在下显示活性增加。误差条代表SD。**（H）**TGFβ-1治疗可刺激MRTF-A依赖的Col1a2启动子活性。CArG盒的突变消除了启动子对MRTF-A或TGFβ-1治疗的反应性。误差条代表SD。

**图8。MI应激反应期间MRTF-A活性的拟议机制**
TGFβ-1水平的增加导致MRTF-A以Rho-ROCK依赖的方式在核内积聚。核MRTF-A以含有基因的CArG盒为靶点，诱导平滑肌和ECM分子的表达，表明肌成纤维细胞类型。

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肌钙蛋白相关转录因子-A：修复破碎的心脏。
Parmacek理学硕士。 Parmacek理学硕士。 Circ Res.2010年7月23日；107(2):168-70. doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.224881。 Circ Res.2010年。 PMID：20651293 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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