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.2010年6月10日；5（6）：e11049。
doi:10.1371/journal.pone.0011049。

循环和肝脏非经典CD14CD16单核细胞升高对炎症和人类肝纤维化的功能作用

亨宁·W·齐默尔曼 1, 塞巴斯蒂安·塞德勒, 雅各布·纳特曼, 尼古拉·加斯勒, 克劳斯·海勒布兰德, 阿尔玛·泽内克, Jens J W Tischendorf公司, 汤姆·卢德, 拉尔夫·魏基尔琴, 克里斯蒂安·特劳特温, 弗兰克·塔克
附属公司

循环和肝脏非经典CD14CD16单核细胞升高对炎症和人类肝纤维化的功能作用

亨宁·W·齐默尔曼等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：单核细胞源性巨噬细胞在肝损伤后持续存在炎症反应，这是器官纤维化的先决条件。实验小鼠模型确定了经典Gr1/Ly6C（+）单核细胞依赖CCR2浸润在肝纤维化中的重要作用。此外，单核细胞相关趋化因子受体CCR1和CCR5最近被认为是小鼠的重要纤维化调节剂。人类单核细胞由经典的CD14（+）CD16（-）和非经典的CD14+CD16（+）细胞组成。我们的目的是调查单核细胞亚群与人类肝纤维化的相关性，并假设在肝脏疾病进展期间，“非经典”单核细胞在患者中严重发挥炎症和促纤维化功能。

方法/主要发现：通过FACS分析，我们分析了226名慢性肝病（CLD）患者和184名健康对照者新鲜采血样本中的循环单核细胞亚群。与对照组相比，CLD患者的循环单核细胞显著扩增，非经典CD14（+）CD16（+）亚群显著增加，患者表现为活化表型，并与促炎细胞因子和临床进展相关。相应地，免疫荧光和FACS显示，CD14（+）CD16（+）巨噬细胞大量积聚在纤维化/肝硬化肝脏中。单核细胞相关趋化因子受体CCR2、CCR1和CCR5的配体在纤维化和肝硬化肝脏中表达较高，而在CLD患者中CCL3和CCL4也呈系统性升高。分离的单核细胞/巨噬细胞亚群在细胞因子/趋化因子表达以及与体外原代人肝星状细胞（HSC）的相互作用方面具有功能特征。CD14（+）CD16（+）单核细胞释放大量促炎细胞因子。此外，CD14（+）CD16（+），而不是CD14（+CD16（-）单核细胞可以直接激活产生胶原蛋白的HSC。

结论/意义：我们的数据表明，随着疾病的进展，CLD患者循环和肝脏中CD14（+）CD16（+）单核细胞的扩张，并表明其在肝硬化中对肝内炎症和促纤维化HSC活化的持续存在的功能性贡献。通过趋化因子/趋化因子受体调节单核细胞亚群募集到肝脏及其随后的分化可能是人类肝纤维化治疗干预的有希望的方法。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。慢性肝病患者的血单核细胞增多，并与疾病进展相关。
（A） 单核细胞由PBMC的CD14染色确定（显示了典型的FACS图）。（B+C）单核细胞相对比例（CD14+)（B）和绝对单核细胞数（C）。（D） 慢性阻塞性肺病患者循环单核细胞与实验室参数的相关性*p<0.05，**p<0.001。
图2
图2。CD14相对增加+CD16型+肝硬化患者的血单核细胞和更多活化表型。
（A） 显示CD14增加的典型FACS图+CD16型+单核细胞（黑栅：CD14+CD16型−，灰色门：CD14+CD16型+)肝硬化患者PBMC与健康对照组和非肝硬化患者的比较（左）。直方图显示CD14上CD16表达的相对分布+细胞（右；灰色：同种型对照）。（B） 单核细胞亚群的统计分析。HC，健康对照组（n=181）；CLD，患者（n=226）；NC，非肝硬化（n=85）；CIR，肝硬化（n=141）。（C） 肝硬化和肝细胞癌（HCC）患者的CD16显著升高（p=0.008）+单核细胞比无HCC的肝硬化患者多。（D） 单核细胞亚群HLA-DR的典型FACS染色。（E） CD16上HLA-DR表达比率+与CD16相比−单核细胞*p<0.05，**p<0.001。
图3
图3。肝内CD16+巨噬细胞在肝纤维化过程中主要增加。
（A） 来自正常肝脏（上图）和肝硬化（下图）的活检的代表性例子显示纤维化门周区域的单核炎症浸润（左：H&E染色，右：Ladewig染色，其中胶原染色为蓝色）。（B） CD14（红色）和CD16（绿色）的免疫荧光共染色可识别CD14+CD16型−和CD14+CD16型+人肝组织中的巨噬细胞（蓝色：细胞核用DAPI复染）。粗体箭头，CD14+CD16型−巨噬细胞；细箭头，CD14+CD16型+巨噬细胞。（C+D）CD14的半定量分析+CD16型−，CD14+CD16型+和总CD14+肝内细胞*p<0.05，**p<0.001。
图4
图4。肝内巨噬细胞由反映血单核细胞亚群的不同亚群组成。
（A） 根据30例以上新鲜肝活检，对肝内单核细胞/巨噬细胞进行FACS分析。将显示代表性绘图。在CD45中+肝内白细胞，三种不同的肝内CD14群体+巨噬细胞可以根据CD14和CD16的表达来区分，这两种表达在HLA-DR和DC-SIGN上也有显著差异。（B） 比较同一患者血液CD14中单核细胞/巨噬细胞活化和分化标记物的表达水平+CD16型−单核细胞（虚线）和肝脏CD14你好CD16型−巨噬细胞（深灰色）和CD14+CD16型+单核细胞（虚线）和肝脏CD14+CD16型+巨噬细胞（浅灰色）；显示了F0纤维化（无纤维化，上面板）和F3纤维化（晚期纤维化，下面板）患者的代表性分析。同位素对照，黑线。在肝脏活检时抽血，同时用相同的FACS设置进行血液/肝脏样本检测。
图5
图5。慢性肝病中单核细胞相关趋化因子途径和单核细胞趋化因子受体的激活。
（A） 趋化因子受体的肝内基因表达水平。（B） 通过FACS评估单核细胞/巨噬细胞（CD14）上CCR2、CCR1和CCR5的表达+，绿色），T-（CD3+CD56型−，浅橙色），NK-（CD3−CD56型+，深橙色）和NKT细胞（CD3+CD56型+，红色）来自新鲜分离的肝组织。显示了具有代表性的直方图，同型控制为灰色。（C） 肝内趋化因子基因表达水平。（D） 慢性肝病患者和健康对照者的单核细胞相关趋化因子血清浓度。缩写为：HC，健康对照；慢性肝病；NC，无肝硬化；CIR、肝硬化*p<0.05，**p<0.001。
图6
图6。慢性肝病患者循环单核细胞趋化因子受体的调节。
（A） CD14微球纯化循环单核细胞后，实时PCR检测单核细胞趋化因子受体基因表达。（B） FACS检测血单核细胞亚群CCR2表达（MFI，平均荧光强度）。缩写为：HC，健康对照；慢性肝病；NC，无肝硬化；CIR，肝硬化。显示了具有代表性的直方图，比较了两个单核细胞亚群之间以及健康对照组和CLD患者外周血中两个单细胞亚群的CCR2表达水平*p<0.05，**p<0.001。
图7
图7。单核细胞在肝硬化中功能活跃，单核细胞亚群释放不同的细胞因子/趋化因子。
（A+B）单核细胞衍生巨噬细胞（培养2天）在无刺激（A）和用1 mg/ml LPS刺激后释放细胞因子/趋化因子（B）。（C） 无刺激培养5天后纯化单核细胞亚群的细胞因子/趋化因子释放*p<0.05，**p<0.001。
图8
图8。CD14号机组+CD16型+，但不是CD14+CD16型−单核细胞直接激活肝星状细胞。
（A） 分离原代人HSC并与CD14共培养5天+CD16型−，CD14+CD16型+单核细胞或淋巴细胞。在这些条件下，HSC上没有发现形态差异。（B） HSC激活由胶原蛋白-1A（col1A）mRNA表达，标准化为“造血干细胞管家基因”学报2（C）CD14表面分子的FACS表达（MFI，平均荧光强度）+CD16型−（CD14）和CD14+CD16型+（CD16）单核细胞/巨噬细胞在第0天，以及在培养或与HSC共培养5天后。所有结果均来自三个独立的实验*p<0.05，**p<0.001。
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