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.2010年9月；84(17):8422-32.
doi:10.128/JVI.00599-10。 Epub 2010年6月10日。

痘苗病毒A25和A26蛋白是成熟病毒的融合抑制物，并决定了株特异性病毒进入HeLa、CHO-K1和L细胞的途径

张淑君 1, 余顺昌, 罗扎·伊兹迈利扬, 银梁汤, 文昌
附属公司

痘苗病毒A25和A26蛋白是成熟病毒的融合抑制物，并决定了株特异性病毒进入HeLa、CHO-K1和L细胞的途径

张淑君等人。 J维罗尔. 2010年9月.

摘要

成熟痘苗病毒通过液相内吞/大胞吞或质膜融合进入细胞。这可能解释了宿主细胞对痘苗病毒进入的广泛敏感性；然而，目前尚不清楚牛痘病毒是如何在这两种途径之间进行选择的，以及哪些病毒包膜蛋白决定了这一过程。通过筛选几种重组病毒和不同菌株，我们发现含有痘苗病毒A25和A26蛋白的成熟病毒优先通过巴非霉素敏感的进入途径进入HeLa细胞，而缺乏这两种蛋白的病毒则通过巴非菌素耐药途径进入。为了研究A25和A26蛋白是否有助于进入途径特异性，随后从野生型WR株中产生了两种突变痘苗病毒WRDeltaA25L和WRDeltaA2 6L。与WR株相比，WRDeltaA25L和WRDeltaA2 6L病毒都对巴非霉素产生耐药性，这表明去除A25和A26蛋白绕过了成熟病毒进入的低H内体要求。事实上，WRDeltaA25L和WRDeltaA2 6L病毒感染HeLa、CHO-K1和L细胞后，立即在感染后1至2小时（p.i.）的中性pH值下触发细胞与细胞融合，提供了直接证据，证明病毒融合机制在去除A25和A26蛋白后很容易被激活，从而允许病毒通过质膜进入。总之，我们的数据支持一个模型，即在痘苗成熟病毒上，病毒A25和A26蛋白是低H敏感性融合抑制物，其在内吞过程中失活导致病毒和细胞膜融合。我们的结果还表明，在病毒粒子形态发生过程中，将A25和A26蛋白并入成熟病毒粒子可能有助于抑制病毒融合活性，直至感染。

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数字

图1。
图1。
IA27L和IA27L-A26WR病毒的BFLA敏感性。（A） 用经DMSO或25 nM BFLA预处理并感染IA27L或IA27L-A26WR病毒的HeLa细胞进行病毒包被检测的免疫荧光显微镜。使用抗A4抗体对未包衣病毒核心进行染色。（B） A中显示的病毒包被试验的定量结果。在A中的每个面板中计算30个细胞的病毒核心数，以获得每个细胞的平均病毒核心数。用DMSO（−）处理的细胞获得的病毒核心数作为100%对照。A4核的百分比计算如下：100×（BFLA处理细胞中每细胞的病毒核数/DMSO处理细胞中的每细胞病毒核数）。实验重复了三次，并显示了标准偏差。（C） 感染IA27L或IA27L-A26WR病毒的HeLa细胞的酸旁路实验。用二甲基亚砜（−）或25 nM BFLA（+）预处理HeLa细胞，然后在4°C下感染IA27L或IA27L-A26WR病毒60分钟。然后用中性（pH 7.4）或酸性（pH 4.7）缓冲液处理细胞3分钟，用PBS洗涤，并在每次2小时采集细胞进行荧光素酶（Luc）分析。用DMSO（−）处理的细胞获得的荧光素酶活性作为100%对照。（D） 含有1μg纯化IA27L和IA27L-A26WR MV颗粒的SDS-PAGE凝胶的银染。箭头标记了质谱鉴定的A25和A26蛋白带。（E） 纯化的IA27L和IA27L-A26WR MV颗粒与抗A25（1:5000）、抗A26（1:1000）、抗A27（1:500）、抗H3（1:1000。
图2。
图2。
两株痘苗病毒株IHD-J和IHD-W对BFLA的敏感性。（B） A.（C）用DMSO或25nM BFLA预处理的HeLa细胞的病毒早期萤光素酶测定的定量结果，随后用IHD-J和IHD-W感染，并在每小时2小时收获用于萤光素酶测定。在没有BFLA（DMSO）的情况下，感染细胞的病毒荧光素酶活性设置为100%。（D） 纯化的IHD-J和IHD-W MV颗粒（1μg）与抗A25（1:5000）、抗A26（1:1000）、抗-A27（1:500）、抗H3（1:1000。
图3。
图3。
（A） 抗-A25抗体阻断了痘苗病毒斑块的形成。BSC40细胞在免疫前（1:100）、抗痘苗病毒MV（抗VV）（1:100；水洗；并用1%琼脂覆盖。每天2天时，将斑块固定，并在计数前用1%结晶紫染色。（B） 包含ORFs A24R至A28L的痘苗病毒基因组示意图。野生型菌株WR显示在顶部，箭头指向转录方向。在WR△A25L和WRΔA26L病毒中，病毒A25L或A26L ORF被一个双表达盒Luc-Gpt取代，该双表达盒包含由病毒早期启动子驱动的荧光素酶（Luc）基因和由病毒p7.5启动子推动的Eco-Gpt（Gpt）基因。（C） 细胞和MV颗粒上A25和A26蛋白表达的免疫印迹分析。用SDS-PAGE分离HeLa细胞裂解物（裂解物）或纯化MV颗粒（MV），并用抗A25、抗A26、抗A27和抗D8抗体进行探测。（D） 野生型痘苗病毒和WRΔA25L和WR△A26L突变病毒的一步生长曲线分析。HeLa细胞以每细胞5个PFU的MOI感染，并在每次0、2、4、8、16、24和48小时采集用于斑块测定分析。（E） 从D所示的感染细胞收集的培养基中测定细胞外病毒滴度。在抗L1 MAb 2D5（1:500）的存在下测定EEV滴度，以阻止污染MV形成斑块。实验进行了两次。
图4。
图4。
野生型痘苗病毒株WR和WRΔA25L和WR△A26L突变病毒对BFLA的敏感性。（A） 用经DMSO或25 nM BFLA预处理并感染野生型痘苗病毒WR和WRΔA25L和WR△A26L突变病毒的HeLa细胞进行病毒包被检测的免疫荧光显微镜。使用抗A4抗体对未包衣病毒核心进行染色。（B） A.（C）用二甲基亚砜或25 nM BFLA预处理的HeLa细胞进行病毒早期荧光素酶检测，随后感染野生型WR、WRΔA25L和WR△A26L病毒，并在每次2小时采集用于荧光素素酶检测的病毒包被检测的定量结果。在没有BFLA（DMSO）的情况下，感染细胞的病毒荧光素酶活性设置为100%。
图5：。
图5：。
在中性pH下，由WRΔA25L和WR△A26L病毒的MV而非wt-WR触发HeLa细胞无细胞融合。（A） 在细胞接种期间，表达RFP和GFP的HeLa细胞以1:1的比例混合。这些细胞感染纯化的wt-WR、WR-ΔA25L和WRΔA26L病毒，MOI为每细胞100 PFU，37°C，在中性pH值下持续60分钟，如材料和方法所述，固定在2 h p.i.，并拍照。合并、红色和绿色免疫荧光图像与细胞形态重叠。（B） 材料和方法中描述的无（A）细胞融合的量化。根据每个细胞的细胞核数量（1、2至10、11至20或>20个细胞核/细胞），将细胞融合百分比量化为四个不同类别。（C） 野生型WR MV仅在低H（pH 4.7）处理后才触发细胞融合。表达GFP-和RFP-的HeLa细胞被上述野生型WR感染（A），并用低h缓冲液（pH 4.7）短暂处理3分钟，在p.i.2小时进行细胞融合并拍照。
图6。
图6。
对由WRΔA25L和WR△A26L病毒MV（而非wt-WR）触发的CHO-K1和L细胞在中性pH下无细胞融合的动力学分析。（A） 如图5A图例所示，CHO-K1细胞在37°C、中性pH条件下以每细胞100 PFU的MOI感染WR、WRΔA25L和WR△A26L病毒60分钟。在30、60和120分钟p.i.时拍摄细胞照片，以监测扁平融合细胞的发生。实验结束时（120 min p.i.），细胞固定，细胞核用DAPI（0.5μg/ml）染色。用荧光染料PKH26对质膜进行染色，以观察细胞形状。（B） 如上所述，将表达RFP-和GFP-的L细胞在中性pH下与wt WR、WRΔA25L和WRΔA26L病毒共培养并感染。在30、60和120分钟p.i.时拍摄细胞照片，以监测扁平融合细胞的发生。实验结束时（120分钟p.i.），固定细胞进行拍照，并显示红色和绿色免疫荧光的融合图像。黄色图像表示融合细胞的区域。
图7。
图7。
肽块细胞融合试验。如《材料和方法》所述，用WRΔA26L病毒模拟感染或感染表达RFP和GFP的L细胞，其中含有或不含有不同浓度的肽（0.1、0.5、1.0或2.0 mg/ml），并在p.i.2 h拍照。A26肽对应于A26蛋白的C末端线圈区域（aa 441至472）。另一个与A26氨基酸序列无同源性的肽作为对照。显示红色和绿色免疫荧光的合并图像。黄色图像表示融合细胞的区域。
图8。
图8。
缺乏完整A25和A26蛋白的痘苗病毒株MVA和哥本哈根在中性pH下触发细胞融合。（A）WR、VV-hr（哥本哈根株）株纯化MV的免疫印迹，以及带有识别病毒A25、A26、A27和H3蛋白的抗体的MVA。（B） 感染菌株IHD-J、IHD-W、VV-hr（哥本哈根）和MVA后，在每天2小时进行细胞融合检测。显示红色和绿色免疫荧光的合并图像。除IHD-J外，所有菌株均观察到代表融合细胞区域的黄色图像。
图9：。
图9：。
由病毒A25和A26蛋白控制的痘苗病毒进入途径的工作模型。我们提出病毒A25和A26蛋白作为痘苗病毒MV颗粒的细胞融合抑制物。疫苗病毒株WR和IHD-J含有A25和A26蛋白，以抑制病毒与细胞质膜的融合。这些MV内化到细胞内小泡中，其中酸性环境（H+)使A25和A26蛋白的融合抑制活性失效，导致病毒膜与内胚体膜融合，将病毒核心释放到细胞质中。相反，缺乏A25和A26蛋白的痘苗病毒株的MV，如株IHD-W、MVA和Copenhagen，在中性-pH环境中通过与质膜融合进入HeLa细胞。C、 病毒核心。
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    1. Bengali，Z.，A.C.Townsley和B.Moss。2009年，疫苗病毒株在细胞附着和进入方面的差异。病毒学389:132-140。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 卡特、G.C.、M.劳、M.霍林斯黑德和G.L.史密斯。痘苗病毒胞内成熟病毒的进入及其与糖胺聚糖的相互作用。《病毒遗传学杂志》。86:1279-1290.-公共医学
    1. Chang，A.和D.H.Metz。1976年，进一步研究痘苗病毒进入细胞的方式。《病毒遗传学杂志》。32:275-282.-公共医学
    1. Ching，Y.C.、C.S.Chung、C.Y.Huang、Y.Hsia、Y.L.Tang和W.Chang。2009年。痘苗病毒A26和A27蛋白C末端的二硫键形成不需要病毒氧化还原酶，并抑制糖胺聚糖介导的细胞融合。J.维罗尔。83:6464-6476.-项目管理咨询公司-公共医学

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