Downregulation of Gadd45beta expression by hepatitis C virus leads to defective cell cycle arrest

doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-4554

.2010年6月15日；70(12):4901-11.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-4554。 Epub 2010年6月8日。

丙型肝炎病毒下调Gadd45beta表达导致细胞周期阻滞缺陷

马丁·希格斯¹, 埃尔维·莱拉特, Jean-Michel Pawlotsky女士

附属公司

PMID： 20530689
预防性维修识别码： PMC3125696型
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-09-4554

丙型肝炎病毒下调Gadd45beta表达导致细胞周期阻滞缺陷

马丁·希格斯等。癌症研究. 2010.

.2010年6月15日；70(12):4901-11.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-4554。 Epub 2010年6月8日。

作者

马丁·希格斯¹, 埃尔维·莱拉特, Jean-Michel Pawlotsky女士

附属

¹法国克雷泰尔国立圣母院U955医学研究所（Institute National de la Santéet de la Recherche Médicale U955）。

PMID： 20530689
预防性维修识别码： PMC3125696型
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-09-4554

摘要

Gadd45家族成员在细胞对基因毒性应激的反应中起着核心作用，并与包括肝细胞癌在内的几种人类癌症有关。丙型肝炎病毒（HCV）慢性感染是原发性肝细胞肿瘤发病和发展的主要危险因素，但其潜在机制尚不清楚。在这里，我们展示了Gadd45beta表达减少与HCV感染之间的新联系。在感染者的非肿瘤组织和肿瘤组织以及含有HCV复制子和感染性HCV株JFH1的细胞系中均观察到Gadd45beta表达受到抑制。在表达整个HCV开放阅读框的转基因小鼠模型中，体内确认Gadd45beta表达降低。从机制上讲，在HCV存在的情况下，Gadd45β启动子的高甲基化是造成这种缺陷的原因。Gadd45beta表达减弱导致异常细胞周期阻滞和DNA切除修复减少。总之，这些结果为HCV相关肝细胞癌的发病机制提供了新的见解，表明Gadd45beta表达降低可能在这一过程中起到了促进作用，并提供了证据表明HCV可能通过改变启动子甲基化来干扰表观基因表达。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：没有。

数字

**图1。丙型肝炎病毒感染患者肿瘤和非肿瘤组织中Gadd45β的表达**
（A） Gadd45β蛋白在未感染（HBV−/HCV−）、HBV感染（HBV+）或HCV感染（HCV+）患者的肿瘤（T）和邻近非肿瘤（NT）肝脏样本中的表达。通过western blotting分析组织样品，显示与18kDa Gadd45β或45kDa肌动蛋白对应的条带。（B） HBV−/HCV−（n=5）、HBV+（n=6）和HCV+（n=7）患者肿瘤和非肿瘤组织的多重western blot分析的密度定量。Gadd45β蛋白水平归一化为肌动蛋白的表达，并显示了与非肿瘤非感染（HBV−/HCV−）组织相关的平均±SEM密度。（C） Gadd45βmRNA在HBV−/HCV−（n=5）、HBV+（n=5）和HCV+（n=7）患者的非肿瘤和肿瘤肝组织中的表达。通过实时PCR测定Gadd45β和SFRS4转录物的表达水平。将数据归一化为SFRS4的表达，并表示为平均值±SEM mRNA表达。（D） HBV−/HCV−（n=5）、HBV+（n=6）和HCV+（n=7）患者非肿瘤和肿瘤肝组织中Gadd45α和Gadd45γmRNA的表达。通过实时PCR定量Gadd45α、Gadd45γ和SFRS4转录物。数据归一化为SFRS4表达，并表示为每个基因的平均±SEM mRNA表达。没有一个比较显示出显著差异。

**图2。携带HCV基因型的肝细胞系中Gadd45β的表达**
1b复制子或感染HCV基因型2a JFH1株。（A）在缺乏和存在HCV基因型1b亚基因复制子的情况下，对Huh7.5细胞中Gadd45β表达进行免疫印迹分析。（B）模拟感染HuAP细胞和感染全长HCV感染变异体JFH1细胞中Gadd45β表达的免疫印迹分析。在每种情况下，通过western blotting分析培养细胞的全细胞裂解物，显示与18kDa Gadd45β或45kDa actin对应的条带。

**图3。整个HCV开放阅读框转基因FL-N/35小鼠中Gadd45β的表达**
（A）使用每个基因型的代表性样本对FL-N/35和wt小鼠中Gadd45β表达进行Western blot分析。对分离肝脏的核提取物进行Gadd45β和lamin A/C表达分析，并指出与这些蛋白对应的条带。（B）未经治疗和苯并[a]芘治疗的wt和FL-N/35小鼠的肝特异性Gadd45βmRNA表达。通过实时定量PCR检测Gadd45β、GusB、GAPDH和HPRT1的表达水平。将结果归一化为GAPDH、GusB和HPRT1的表达，与未经处理的wt对照组相比，表达的平均±SEM mRNA数量。使用Mann-Whitney非参数检验分析统计显著性。（C） FL-N/35肝细胞中的Gadd45β启动子活性。将来自wt或FL-N/35动物的分离肝细胞与pmaxGFP和表达萤火虫荧光素酶的质粒共转染，在人Gadd45β启动子（pGL2-Gadd45？luc）或SV40启动子（p GL2）的控制下，模拟照射或用UV-C处理。平均±SEM荧光素酶水平（归一化为GFP表达）从三个独立的实验中可以看出，这些实验与未经处理的wt肝细胞的实验结果有关。采用Mann-Whitney非参数检验对数据的统计学意义进行分析。

**图4。FL-N/35小鼠Gadd45β启动子的高甲基化**
（A）在存在和不存在5-氮杂胞苷的情况下，来自wt或FL-N/35动物的模拟照射或紫外线照射的原代肝细胞中Gadd45β转录物的表达。通过定量RT-PCR测定Gadd45β和肌动蛋白mRNA的表达水平。来自三个独立实验的数据被归一化为β-肌动蛋白的表达，并相对于未经处理的体重对照组进行表达。采用Mann-Whitney非参数检验分析差异的统计显著性。（B）甲基化特异性PCR分析wt或FL-N/35动物肝细胞DNA中Gadd45β启动子甲基化。U表示非甲基化PCR产物，M表示高甲基化PCR产品。

**图5。原代wt或FL-N/35肝细胞的有丝分裂指数和DNA修复分析**
（A）磷酸化组蛋白-H3的免疫荧光检测。分析细胞是否存在磷酸化组蛋白H3（左面板），并用DAPI（右面板）对细胞核进行复染。显示了磷酸化组蛋白H3和DAPI信号的代表性图像（放大40倍）。比例尺=10μm。（B）有丝分裂指数的定量分析。随后，对接受所示siRNA或非沉默对照的分离细胞进行模拟处理或用5-氮杂胞苷处理12小时。然后模拟照射单层或用UV-C处理单层，并在照射后6小时分析磷酸化组蛋白-H3的存在。对于每个视野（放大40倍），对磷酸化组蛋白H3阳性细胞和DAPI阳性细胞进行量化。数据表示为每个视野中磷脂酶H3阳性细胞的百分比，并表示来自两个独立实验的至少300个细胞的分析。采用Mann-Whitney非参数检验分析差异的统计显著性（见正文）。（C）原代wt和FL-N/35肝细胞的DNA切除修复能力。将分离自wt或FL-N/35动物的原代肝细胞与pmaxGFP和UV-C照射的pGL2共转染。转染48小时后检测荧光素酶水平，并将其归一化为GFP表达。计算了相对于wt对照培养物的DNA修复效率，并显示了三个独立实验的平均±SEM修复效率。采用Mann-Whitney非参数检验分析统计显著性。

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