Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver

doi:10.1194/jlr.M004648

.2010年9月；51(9):2571-80.

doi:10.19194/jlr。M004648中。 Epub 2010年6月6日。

胰高血糖素在肝脏三酰甘油积累过程中调节脂肪分化相关蛋白的细胞内分布

高桥胜彦¹, 佐佐直子, 大岛久美子, 北田敬子, 里娜·加藤, Yutaka Masuda公司, Mika Tsurumaki先生, 高桥·奥巴马, 大久田信一（Shin-ichi Okudaira）, 青木军, Hiroyuki Arai公司, 山口友弘, Hiroyuki Itabe公司

附属公司

PMID： 20529882
预防性维修识别码：项目经理2918440
内政部： 10.1194/jlr。M004648号

胰高血糖素在肝脏三酰甘油积累过程中调节脂肪分化相关蛋白的细胞内分布

高桥胜彦等。脂质研究杂志. 2010年9月.

.2010年9月；51(9):2571-80.

doi:10.19194/jlr。M004648中。 Epub 2010年6月6日。

作者

高桥胜彦¹, 佐佐直子, 大岛久美子, 北藤惠子, 里娜·加藤, Yutaka Masuda公司, Mika Tsurumaki先生, 高桥·奥巴马, 大久田信一（Shin-ichi Okudaira）, 青木军, 荒井博之, 山口友弘, Hiroyuki Itabe公司

附属

¹日本东京昭和大学药学院生物化学系。

PMID： 20529882
预防性维修识别码：项目经理2918440
内政部： 10.1194/jlr。M004648号

摘要

细胞脂滴（LD）是参与细胞脂质代谢的细胞器。当使用蔗糖密度梯度离心法分离肝细胞成分时，脂肪分化相关蛋白（ADRP）分布在正常喂养条件下小鼠肝脏的顶部和底部部分，分别对应于LD和膜部分。隔夜禁食后，小鼠肝脏中的三酰甘油和ADRP增加了近2.5倍，部分出现在中等密度LD（iLD）组分中。在由甲硫氨酸/胆碱缺乏饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型中，iLD组分中的ADRP也增加。当HuH-7人肝癌细胞与油酸孵育24小时时，ADRP的数量增加，并且分布在LD和膜组分中。然而，用胰高血糖素处理HuH-7细胞后，iLD组分中出现ADRP。ADRP的这种行为依赖于cAMP，因为ADRP阳性的iLD部分由二丁基cAMP诱导，并被蛋白激酶A抑制剂阻断。通过用油酸和胰高血糖素处理HuH-7细胞或人类原代肝细胞，而不是单独用油酸处理，ADRP的一部分与iLD组分中存在的calnexin在显微镜下共定位。胰高血糖素在内质网膜重组中发挥作用，在肝细胞中生成ADRP相关的低脂颗粒，这与脂质储存期间LD的形成有关。

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数字

**图1。**
ADRP在禁食小鼠肝脏中的蓄积.A：研究了禁食对组织中ADRP蛋白水平的影响。雄性C57BL/6小鼠（10周龄）要么喂食，要么禁食16小时，实施安乐死，然后恢复大脑、心脏、肝脏、骨骼肌和WAT。对每种小鼠组织中的ADRP蛋白水平进行免疫印迹分析，并通过密度扫描定量ADRP和β-肌动蛋白检测条带的强度。1.0的相对指数是喂食小鼠肝脏中的ADRP/β-肌动蛋白。条形图显示了三只老鼠的平均值和标准偏差。B：禁食改变了另一种LD蛋白TIP47和参与脂质代谢的酶SCD-1的水平。在PAT家族蛋白中，未检测到紫苏素。通过密度扫描定量ADRP、TIP47、SCD-1和β-肌动蛋白检测带的强度。ADRP，脂肪分化相关蛋白；LD，脂滴；SCD-1，硬脂酰辅酶A去饱和酶-1；TIP47；47kDa的尾部相互作用蛋白；WAT，白色脂肪组织。

**图2。**
禁食肝脏中出现中等密度的ADRP-LD。A： ADRP、TIP47、MTP、GRP78/BiP和Raf-1的配置文件。通过蔗糖密度梯度离心分离在喂养条件下和禁食16小时后来自小鼠的肝脏PNS级分。MTP和GRP78/BiP是ER的标记蛋白；Raf-1是细胞溶质的标记物。用免疫印迹法分析蔗糖密度梯度离心所得的各组分。虽然我们尚未进行定量确认，但禁食肝脏中的MTP似乎增加。B： ADRP水平在密度梯度中的分布。通过密度扫描定量ADRP检测带的强度。相对指数1被定义为分数1中ADRP的强度。C： TG水平在密度梯度中的分布。按照“实验程序”中的描述定量测量每个组分的TG水平。1的相对指数是组分1中的TG含量。ADRP，脂肪分化相关蛋白；GRP78/BiP，78-kDa/结合蛋白的葡萄糖调节蛋白；LD，脂滴；微粒体三酰甘油转移蛋白；PNS，核后上清液；甘油三酯；TIP47；47kDa的尾部相互作用蛋白。

**图3。**
ADRP在MCD饮食诱导脂肪肝iLD组分中的分布.用蔗糖密度梯度超速离心法分离喂食MCD饮食2周前后小鼠的肝匀浆。A：通过酶法定量测定肝匀浆中的TG水平。B：甘油三酯在肝脏中的分布。测量每个组分中的TG水平。插图显示了iLD组分中TG分布的详细模式。C：用免疫印迹法检测肝匀浆中的ADRP和GAPDH。D、 E：通过免疫印迹分析分馏后ADRP的分布，并通过密度扫描定量带强度（n=3）。相对指数1定义为对照小鼠（0周治疗）肝脏中的ADRP/GAPDH比率。^**P（P）*< 0.05,^***P（P）*< 0.01,^****P（P）*< 0.005. ADRP，脂肪分化相关蛋白；iLD，中等密度脂滴；MCD，甲硫氨酸/胆碱缺乏；TG、三酰甘油。

**图4。**
胰高血糖素诱导HuH-7人肝癌细胞iLD组分出现ADRP.A：将HuH-7细胞与0.6 mM OA或不与之孵育24小时，在另一组细胞中添加100 nM胰高血糖素24小时，然后通过蔗糖超速离心分离细胞裂解液。将每个级分的相同体积（8μl）应用于SDS-PAGE，并用抗ADRP抗体进行免疫印迹。B：如上所述处理HuH-7细胞，并测量细胞裂解液中的TG量。C：将含有或不含胰高血糖素的OA孵育细胞中的TG分为三个组分：LD组分（Fr.No.1-3）、iLD组份（Fr..No.5-9）和高密度组分（Fl.No.11-15），以此评估TG在细胞中的分布。D、 E：用含或不含胰高血糖素的OA培养的细胞中ADRP和TG在蔗糖超速离心分离的每个组分中的分布。通过密度扫描定量ADRP检测带的强度。相对指数1被定义为用OA和胰高血糖素处理的HuH-7细胞1号组分中ADRP的强度。ADRP，脂肪分化相关蛋白；iLD，中等密度脂滴；OA，油酸；TG、三酰甘油。

**图5。**
与OA和胰高血糖素孵育后，ADRP和其他蛋白在HuH-7细胞中的分布。A：将HuH-7细胞与OA（0.6 mM）和胰高血糖素（100 nM）孵育24 h。然后通过蔗糖超速离心分离细胞裂解液，并通过Western blotting检测ADRP、烯醇化酶、BiP/GRP78和calnexin的分布。B：用蔗糖超速离心法分离未经OA和胰高血糖素处理的HuH-7细胞的裂解液，用Western blotting检测BiP/GRP78和calnexin的分布。ADRP，脂肪分化相关蛋白；GRP78/BiP，78-kDa/结合蛋白的葡萄糖调节蛋白；OA，油酸。

**图6。**
与OA或OA和胰高血糖素孵育后，ADRP和其他蛋白质在HuH-7细胞中分布的显微镜视图。用OA（0.6 mM）或OA加胰高血糖素（100 nM）处理HuH-7细胞24小时。A-D：用抗ADRP IgG（红色）结合BODIPY493/503、抗calnexin抗体、GRP78/BiP或烯醇化酶（绿色）对细胞进行染色。细胞也用DAPI处理以染色细胞核（蓝色）。（A）中的插图是用OA和胰高血糖素处理的HuH-7细胞中LD颗粒的放大图像，显示ADRP包围着大小LD颗粒。使用共焦激光显微镜对细胞进行可视化和拍照。条形图显示为10μm。ADRP，脂肪分化相关蛋白；GRP78/BiP，78-kDa/结合蛋白的葡萄糖调节蛋白；LD，脂滴；OA，油酸。

**图7。**
与OA或OA和胰高血糖素孵育后人类原代肝细胞中ADRP和其他蛋白质分布的显微镜图.用OA（0.6 mM）或OA加胰高血糖素（100 nM）处理人类原代肝细胞24小时。A-D：如图6所示，用抗ADRP IgG（红色）、BODIPY493/503、抗钙联蛋白或抗GRP78/BiP抗体（绿色）对细胞进行染色。细胞也用DAPI处理以染色细胞核（蓝色）。使用共焦激光显微镜对细胞进行可视化和拍照。条形图显示10μm。ADRP，脂肪分化相关蛋白；GRP78/BiP，78-kDa/结合蛋白的葡萄糖调节蛋白；OA、油酸。

**图8。**
在HuH-7人肝癌细胞中，PKA和PLC依赖性通路诱导iLD组分出现ADRP。A：将HuH-7细胞与0.6 mM OA和100μM二丁酰cAMP（db-cAMP）孵育24 h，然后用蔗糖超速离心分离细胞裂解液，并检测ADRP的分布。B：用0.6 mM OA加100 nM胰高血糖素或100μM db-cAMP孵育HuH-7细胞，以诱导ADRP重新分布到iLD部分。此外，在24小时培养期间向细胞中添加PKA抑制剂Rp（20μM）或PKI（50 nM）。B：用0.6 mM OA和100 nM胰高血糖素培养HuH-7细胞，以诱导ADRP重新分布到iLD部分。此外，在24小时培养期间向细胞中添加PLC抑制剂U-73122（5μM）。ADRP，脂肪分化相关蛋白；GRP78/BiP，78-kDa/结合蛋白的葡萄糖调节蛋白；iLD，中等密度脂滴；OA，油酸；蛋白激酶A；PKI，PKI14-22酰胺；磷脂酶C；Rp、Rp-8-Br-cAMPS。

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