Glucose addiction of TSC null cells is caused by failed mTORC1-dependent balancing of metabolic demand with supply

doi:10.1016/j.molcel.2010.05.007

.2010年5月28日；38(4):487-99.

doi:10.1016/j.molcel.2010.05.007。

TSC阴性细胞的葡萄糖成瘾是由代谢需求与供应的mTORC1依赖性平衡失败引起的

安德鲁·周一岳（Andrew Y Choo）¹, Sang Gyun Kim先生, 马修·范德·海登, 莎拉·马奥尼, Hieu Vu公司, Sang-Oh Yoon先生, 刘易斯·坎特利, 约翰·布莱尼斯

附属公司

PMID： 20513425
预防性维修识别码：项目经理2896794
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2010.05.007

TSC阴性细胞的葡萄糖成瘾是由代谢需求与供应的mTORC1依赖性平衡失败引起的

安德鲁·周一岳（Andrew Y Choo）等。分子电池. 2010.

.2010年5月28日；38(4):487-99.

doi:10.1016/j.molcel.2010.05.007。

作者

安德鲁·周一岳（Andrew Y Choo）¹, Sang Gyun Kim先生, 马修·范德·海登, 莎拉·马奥尼, Hieu Vu公司, Sang-Oh Yoon先生, 刘易斯·坎特利, 约翰·布莱尼斯

附属

¹哈佛医学院细胞生物学系，美国马萨诸塞州波士顿02115。

PMID： 20513425
预防性维修识别码：项目经理2896794
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2010.05.007

摘要

mTORC1信号途径通过平衡合成代谢和分解代谢过程，将环境条件整合为细胞生长的不同信号。因此，能量应激主要通过AMPK依赖性激活TSC1/2来抑制mTORC1信号。因此，TSC1/2-/-细胞对葡萄糖缺乏过敏，这与p53翻译增加和凋亡激活有关。在此，我们表明，在葡萄糖剥夺期间抑制mTORC1不仅可以防止死亡，还可以防止能量应激的诱导。在葡萄糖剥夺期间抑制mTORC1可降低AMPK激活，并使ATP保持较高水平，这对保护既必要又充分。这种影响并不是由于分解代谢活动增加，例如自噬，而是完全由于合成代谢过程减少，从而减少能量消耗。具体而言，TSC1/2-/-细胞通过TCA循环高度依赖谷氨酸脱氢酶依赖的谷氨酰胺代谢来生存。因此，在能量应激期间抑制mTORC1主要是为了平衡代谢需求和供应。

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数字

**图1。mTORC1抑制保护*TSC公司*葡萄糖缺乏引起的缺陷细胞通过*第53页*-独立机制**
答：。*TSC1+/+p53+/+*和*TSC1-/-p53+/+*使用或不使用雷帕霉素将MEF中的葡萄糖剥夺48小时，并使用相差显微镜观察细胞活力。B.通过碘化丙啶（PI）排除试验测定A的细胞活力。在加入或不加入雷帕霉素的情况下，将ELT-3和LExF的葡萄糖剥夺72小时。D.的相位图*TSC2-/-p53-/-*或*TSC2+/+p53-/-*MEF剥夺葡萄糖60小时。E.p53蛋白的Western blot。F.猛禽击倒后D.G.细胞活力的PI-排除分析。H.猛禽和磷酸化S6K1的击倒效率。所示为3个独立实验的平均值（+SEM）。

**图2。mTORC1抑制在缺乏葡萄糖的情况下维持细胞生物能量学**
A.细胞形态*TSC2-/-p53-/-*控制和Bcl-X_L（左）停糖48小时后表达细胞。B.Bcl-X的表达水平_L（左）以及S6K1的磷酸化。C.细胞活力*TSC2-/-p53-/-Bcl-X_L（左）*取血清后96小时的细胞。D.控制或Bcl-X的可行性_L（左）表达*TSC2-/-p53-/-*葡萄糖缺乏60小时的MEF。所示为3个独立实验的平均值（+SEM）。E.细胞大小*TSC2-/-p53-/-Bcl-X_L（左）*MEF公司。葡萄糖剥夺后F肌动蛋白与G肌动蛋白人群*TSC2-/-p53-/-Bcl-X_L（左）*MEF公司。JASP=茉莉酮内酯（1μM）。LatA=Latrunculin A（2μM）。G.控制或Bcl-X中的细胞ATP水平_L（左）在用雷帕霉素或不用雷帕霉素剥夺葡萄糖24小时后测定表达的MEFs。对照细胞以相同的密度进行培养，并在葡萄糖缺乏时给予新鲜培养基。H.在24小时葡萄糖剥夺后测量ATP水平*TSC2系统+/+*和*TSC2系统-/-*细胞。I.与H相同条件下的ATP和ADP水平；ATP：p<0.0001；ADP：p=0.11 J。ATP/ADP比值由H.K.AMPKα磷酸化（Thr172）测定，ACC磷酸化在停糖24小时后测定。

**图3。在缺乏葡萄糖的情况下，赖氨酸介导的ATP维持需要L-谷氨酰胺**
*A.TSC2-/-p53-/-*MEF被剥夺了葡萄糖和氨基酸，或两者都含有或不含有雷帕霉素。B.具有支链氨基酸（BCAAs）、L-谷氨酰胺或总氨基酸缺失的细胞的细胞活力。C.在葡萄糖剥夺24小时后测定细胞总ATP水平。D.剥夺24小时后S6K-1（T389）磷酸化。在剥夺时，将L-谷氨酰胺添加到葡萄糖和总氨基酸被剥夺的条件中，并在停药后60小时测定存活率。F.衡量*TSC2-/-p53-/-*MEF生长在完全（-）葡萄糖、（-）谷氨酸（-）AA和（-）Glu（-）AA+4mM L-谷氨酰胺培养基中。从48小时开始，只向标有X的样品补充谷氨酰胺（2mM），每24小时补充一次。Rap X样品在0和72小时时也获得了20nM雷帕霉素。G.分别于第3天和第6天在（-）葡萄糖（-）氨基酸条件下进行或不进行L-谷氨酰胺（2mM）再处理时拍摄相位图像。所示为3个独立实验的平均值（+SEM）。

**图4。雷帕霉素治疗后线粒体活性没有增加*TSC2-/-p53-/-*MEF公司**
*A.TSC2-/-p53-/-*MEFs被剥夺葡萄糖24小时，并测量耗氧量。用克拉克电极测量耗氧量，测定耗氧量并以每百万个细胞每分钟耗氧量nmol表示。实验进行了3次，得到了类似的结果。B.在处理后12和24小时，通过FACs通过DiOC6 MFI测量线粒体膜电位。在含葡萄糖培养基中生长的细胞中，使用寡霉素作为阳性对照（5μg/mL）。（n=3）C.在剥夺24小时后测定PGC-1α和细胞色素C蛋白水平。D.在没有葡萄糖的情况下，以及在有或没有雷帕霉素的情况下进行线粒体跟踪器测量。

**图5。mTORC1调节代谢消耗，调节消耗对于调节缺乏葡萄糖的生存是必要的和足够的**
*A.TSC2-/-p53-/-*MEF与雷帕霉素培养24小时，环己酰亚胺（CHX）（5μg/mL）培养12小时，氨基酸缺失培养基与谷氨酰胺（-）AA（+）Gln培养12小时。随后，将细胞在（-）Glu（-）AA培养基中进行短暂清洗，并用含有寡霉素（10μg/mL）和抗霉素A（2μg/mL）的无糖培养基培养。将（-）AA（+）Gln样品与寡霉素和抗霉素在（-）Glu，（-）AA+Gln培养基中培养。细胞立即在37°C下培养，并在指定的时间点测量ATP水平。用于清洗和培养的所有培养基始终保持在37°C。实验以五倍的形式进行，数据以对照的百分比表示，即在无糖/寡霉素/抗霉素培养基中培养之前的ATP水平。学生t检验：与对照组相比，*p<0.001。B.在葡萄糖缺乏24小时后测量ATP水平*TSC2-/-p53-/-*用雷帕霉素（20nM）、哇巴因（1mM）和雷帕霉素/革兰菌素D（1μg/mL）培养MEF。GramD=禾本科菌素D；学生t检验：（-）谷氨酸与（-）Glu+哇巴因比较：p<0.01 C。在葡萄糖剥夺60小时后测量细胞存活率。D.在葡萄糖剥夺后60小时，测量指示浓度下的革兰菌素D对细胞活力的影响。E.除了使用CHX（5μg/mL）外，ATP水平的测量与A类似。在裂解前5小时，向两个样品中均给予革兰氏菌素D（2μg/mL）。使用2μg/mL是因为我们观察到需要更高的浓度才能对环己酰亚胺处理的细胞产生更显著的影响。F.在指定的时间点用PI-隔离试验测量各组的细胞存活率。G.用雷帕霉素、哇巴因（1mM）和CHX（5μG/mL）处理24小时无糖细胞，测定S6K1（T389）的激活状态。所示为所有活力实验的3个独立实验的平均值（+SEM）。

**图6。只有在能量消耗降低时，TCA循环中间产物才能替代谷氨酰胺**
A.显示TCA循环中间产物和本研究所用化合物的图表用*表示。B。*TSC2-/-p53-/-*MEF被剥夺葡萄糖，并给予额外的4mM或8mM谷氨酰胺，使最终浓度达到4mM、8mM和12mM。在剥夺后60小时测量细胞活力。C、。*TSC2-/-p53-/-*MEFs被剥夺了氨基酸和葡萄糖，并被给予指示的分子。剥夺后48小时测量细胞活力。所示为3个独立实验的平均值（+SEM）。

**图7。谷氨酰胺代谢途径的药物抑制在葡萄糖限制条件下诱导细胞毒性**
A.显示谷氨酸代谢相关酶的图表（更多细节请参阅正文）。B.EGCG（50μM）和AOA（0.25至5.0 mM）的细胞毒性试验*TSC2系统-/-*剥夺葡萄糖并给予雷帕霉素的细胞（剥夺48小时后）。如有指示，还补充了各种代谢物α-酮戊二酸（10mM）、谷氨酸（4mM）和丙酮酸（1mM）。C、。*TSC2系统-/-*细胞被靶向GDH的shRNA构建物（#1-4）感染，在没有葡萄糖和雷帕霉素的情况下，60小时后的存活率显示出来。D。*TSC2系统-/-*给缺乏葡萄糖和氨基酸但补充谷氨酰胺（4mM）的细胞注射EGCG（50μM）或AOA（2mM）。

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中的注释

新陈代谢（重新）平衡行为。
Abraham RT，工程师CH。 Abraham RT等人。分子细胞。2010年5月28日；38(4):481-2. doi:10.1016/j.molcel.2010.05.008。分子细胞。2010 PMID：20513422

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