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.2010年6月；51(6):1998-2007.
doi:10.1002/hep.23599。

进行性非酒精性脂肪性肝病中自然杀伤T细胞的积聚

Wing-Kin同步 1, 叶吞乌, 蒂亚戈·佩雷拉, 游戏F卡拉卡, 容美美（Youngmi Jung）, 阿莱西亚·奥梅内蒂, 拉斐尔·维特克, 史蒂夫·S·崔, 辛西娅·D·盖伊, Caitlin M恐惧, 瓦妮莎·塔贝里, 福斯托·E·L·佩雷拉, 大卫·H·亚当斯, 安娜·梅·迪尔
附属公司

进行性非酒精性脂肪性肝病中自然杀伤T细胞的积聚

Wing-Kin同步等。 肝病学. 2010年6月.

摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的肝脏炎症程度高于脂肪变性患者，这表明免疫反应有助于非酒精性肥胖性肝病（NAFLD）的进展。肝脏通常含有许多自然杀伤T（NKT）细胞，这些细胞产生调节炎症和纤维化反应的因子。脂肪变性时，这些细胞相对耗竭，但其在更晚期NAFLD中的状态尚不确定。我们假设NKT细胞在NASH中积聚并促进纤维化进展。我们的目的是确定在NASH相关纤维化期间肝脏是否富含NKT细胞；确定责任机制；并评估NKT细胞是否刺激纤维生成。在喂食蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食以诱导NASH相关纤维化之前和之后，分析野生型小鼠和具有过度活跃Hedgehog（Hh）通路的补丁缺陷（Ptc（+/-））小鼠的NKT细胞。检测NKT细胞衍生因子对肝星状细胞（HSC）的影响，并在缺乏NKT淋巴细胞的CD1d缺陷小鼠中评估纤维化。对人类肝硬化和非病变肝脏中的NKT细胞进行定量。在野生型小鼠NASH相关纤维化形成过程中，Hh途径激活，导致诱导促进NKT细胞募集、保留和存活的因子，以及肝脏中NKT淋巴细胞的富集。Ptc（+/-）小鼠积聚更多NKT细胞，肝纤维化加重；缺乏NKT细胞的CD1d缺乏小鼠可免受纤维化的影响。NKT细胞条件培养液刺激HSC成为肌纤维母细胞。非NASH肝硬化患者的肝外植体中NKT细胞富集2倍，NASH肝硬化的肝外移植体中NK细胞富集4倍。

结论：Hh途径激活导致肝脏中NKT细胞的富集，这有助于NASH的纤维化进展。

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数字

图1
图1。当喂食蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食时，小鼠发生NASH纤维化
野生型小鼠被喂食对照周（n=25）或MCD饮食（n=2 5）8周，然后处死。（A） 代表性苏木精和伊红（最终放大400X，插入MCD小鼠肝脏H&E染色切片，显示肝细胞膨胀）（B）MCD饮食后天狼星红染色（最终放大200X）。（C） 通过形态计量分析对天狼星红进行量化，以及治疗期结束时（D）肝脏羟脯氨酸含量。结果表示为相对于对照组喂食小鼠的折叠变化。（E） αSMA免疫反应（最终放大400X）和（F）αSMA形态计量学。在每个时间点使用来自5只动物的切片，并随机选择10个400X的字段，通过Metaview软件进行分析。结果表示为相对于喂食对照组小鼠的折叠变化，并以平均值±SEM表示。*与对照组小鼠相比，P<0.05。
图2
图2。Hedgehog通路的激活促进小鼠NASH中NKT的募集和静态粘附
采集图图例1所示小鼠的肝组织进行QRT-PCR和免疫组织化学。（A） MCD饮食治疗小鼠的典型Gli2染色（最终放大400X）和Gli2、（B）cxcl16和（C）vcam-1的mRNA表达。结果表示为相对于喂食对照小鼠的折叠变化，并以平均值±SEM表示。（D）DN32对未成熟导管细胞（603B）的静态粘附，用Sonic hedgehog和/或5E1（hedgehog-中和抗体）处理。（E） DN32对603B细胞和肌纤维母细胞系（8B）共培养24小时的静态粘附。结果表示为相对于车辆处理的导管细胞或导管细胞单培养物的粘附DN32细胞数量的折叠变化*与对照组小鼠相比，P<0.05。实验重复进行两次。
图3
图3。NASH纤维化与肝NKT细胞的富集有关
8周结束时，处死喂食对照组和喂食MCD的小鼠（n=15/组），并对肝脏总RNA进行QRT-PCR分析，以评估NKT生存因子的表达。（A） cd1d和（B）il15 mRNA。结果表示为相对于喂食对照组小鼠的折叠变化，并以平均值±SEM表示。*与对照喂食组小鼠相比，P<0.05。（C-D）额外的小鼠（n=10/组）用对照周或MCD饮食治疗8周；整个肝脏用于FACS分析。在喂食食物的对照（C）或MCD处理的小鼠（D）中CD4/CD1d四聚体双重染色。所有小鼠的肝脏用于FACS分析。NASH肝脏（E）肝实质（E-F）CD57免疫反应性T细胞与正常肝脏（F）的比较（最终放大400X）。对每组4只小鼠的切片进行分析。
图4
图4。Ptc饮食诱导NASH期间肝内NKT细胞积聚增加+/-具有过度活跃Hedgehog通路的小鼠以及对缺乏NKT细胞的CD1d缺陷小鼠MCD饮食诱导的纤维化的保护
私人投资公司+/-给小鼠喂食常规食物（n=2）或MCD饮食（n=2.）8周。治疗期结束时，处死所有小鼠，分离肝内单核细胞进行FACS分析。（A） 猪瘟Ptc中CD4/CD1d-四聚体双阳性细胞+/-小鼠和（B-C）MCD膳食Ptc+/-老鼠。CD1d-缺乏小鼠和窝鼠野生型（WT）对照组被喂食对照周或MCD饮食8周（n=3只小鼠/组/饮食治疗）。通过评估（E）肝羟脯氨酸含量和对（F）肝胶原基因表达进行QRT PCR分析来评估纤维化。结果表示为平均值+/-SEM。*P<0.05，**P<0.005
图5
图5。α-半乳糖基神经酰胺处理的小鼠原代肝NKT细胞诱导原代肝星状细胞活化
分离的小鼠原代肝单个核细胞（MNC）（5×104)在完整的NKT培养基中培养，并用载体或α半乳糖神经酰胺处理24小时。然后将细胞条件化介质添加到小鼠肝星状细胞原代培养物中再培养24小时；然后收获星状细胞，并通过QRT-PCR分析评估基因表达的变化。（A） gli1、（B）foxf1、（C）胶原蛋白1α1、（D）αsma、（E）tgfβ和（F）ctgf。结果表示为相对于用“vehicle-MNC”条件介质处理的星状细胞的折叠变化。绘制了重复实验的平均值±SEM*与载体-MNC处理的星状细胞相比，P<0.05。
图6
图6。人类NASH中肝脏NKT细胞的积累伴随着Hedgehog通路的激活
（A-C）对NASH患者的肝切片和轻度纤维化（F0-1）或晚期纤维化（F3-4）进行染色，以确定激活的肌成纤维细胞、αSMA（A）、Hh-调节的NKT趋化因子、CXCL16（B）和NKT细胞的标记物，即CD3（蓝色）/CD57（棕色）双免疫反应细胞。显示了具有代表性的显微照片。最终放大400倍（A、B）和600倍（C）。
图7
图7。肝硬化患者肝单个核细胞与NKT细胞的富集
从接受肝移植的患者（n=4）的移植肝脏、结直肠癌肝转移切除过程中切除的非病变肝组织（n=2）以及劈离移植过程中获得的多余肝组织（n=2）中分离出肝浸润性白细胞，并通过FACS进行分析。（A-B）NASH肝硬化、（C）丙型肝炎肝硬化、（D）自身免疫性肝炎和（E-F）非病对照肝。NKT细胞为CD3/CD56双阳性细胞。
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