Superoxide is an associated signal for apoptosis in axonal injury

doi:10.1093/brain/awq105

.2010年9月；133(9):2612-25.

doi:10.1093/brain/awq105。 Epub 2010年5月21日。

超氧化物是轴突损伤中细胞凋亡的相关信号

金森明也¹, 玛丽亚·玛格达莱娜·卡特里内斯库, 诺里科·卡纳莫利, 卡特里娜飓风, 雷切尔·博宾, 伦纳德·A·莱文

附属公司

PMID： 20495185
预防性维修识别码： PMC2929329型
内政部： 10.1093/brain/awq105

超氧化物是轴突损伤中细胞凋亡的相关信号

金森明也等。大脑. 2010年9月.

.2010年9月；133(9):2612-25.

doi:10.1093/brain/awq105。 Epub 2010年5月21日。

作者

金森明也¹, 玛丽亚·玛格达莱娜·卡特里内斯库, 诺里科·卡纳莫利, 卡特里娜飓风, 雷切尔·博宾, 伦纳德·A·莱文

附属

¹蒙特利尔大学Maisonneuve-Rosemont医院研究中心和眼科，5415 boul。加拿大魁北克省蒙特利尔市，de l'Asomption。

PMID： 20495185
预防性维修识别码： PMC2929329型
内政部： 10.1093/brain/awq105

摘要

视神经病变是不可逆失明的主要原因，也是中枢神经系统轴突疾病的典型表现。主要事件是视网膜神经节细胞轴突受损，随后细胞体因凋亡而死亡。对这些和其他神经疾病的神经保护试验大多失败了，主要是因为动物的神经保护机制不一定能转化为人类的神经保护。我们开发了一种方法，用于成像活体动物神经元死亡信号的细胞内转导途径。使用纵向共焦扫描多激光眼底镜，我们确定了视神经横断后逆行标记的大鼠视网膜神经节细胞内超氧化物的产生。通过对其与玻璃体内注射的氢乙硫胺反应产物的实时成像，对超氧化物进行可视化，并通过特定产物2-羟基乙硫胺的差分光谱进行确认。视网膜神经节细胞超氧物在轴切开后24小时内增加，4天达到峰值，对侧无损伤眼未观察到。超氧物信号先于磷脂酰丝氨酸外化，表明超氧物生成是一个早期事件，先于细胞凋亡。玻璃体内聚乙二醇化超氧化物歧化酶阻断了轴切开术后超氧化物的生成，延缓了视网膜神经节细胞的死亡。总之，这些结果与超氧化物是视神经损伤后视网膜神经节细胞凋亡的上游信号相一致。超氧物早期检测轴突损伤可作为视神经病变患者的预测性生物标志物。

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数字

图1
CSLO视网膜成像地形图示意图。为了量化各种荧光阳性细胞的数量（例如OH-Et和annexin V），在靠近视神经头的每个视网膜八分之一处拍摄了八张图像。

图2
视神经切断导致成像时视网膜内出现OH-Et阳性细胞体内由CSLO提供。(A类)实验流程图。(B类)OH-Et-阳性细胞的概述由九幅CSLO图像的蒙太奇组成。(C类)视神经切断后CSLO检测OH-Et阳性的时间进程。OH-Et阳性率在第4天达到最大值。ONT=视神经横断。

图4
用CSLO检测HEt的氧化产物。HEt在含有或不含有DNA的X/XO或过氧化氢的微量离心管中培养。(A类)CSLO上的管子图像。(B类)当HEt与X/XO（正方形）和DNA（固体符号）孵育时，荧光迅速增加。相反，HEt与含有或不含（开放符号）DNA的过氧化氢（圆圈）孵育后，荧光增加最小。

图5
根据HEt的CSLO成像显示为荧光的轴切RGC包含OH-Et，HEt和超氧化物的产物，基于HEt的解剖相关性体内和体外通过荧光显微镜研究图像。(A类)覆盖在相应CSLO图像上的全安装视网膜的表观荧光显微镜概述.箭头表示荧光细胞。箭头表示同一船只上用于图像注册的相应位置。(B类)通过落射荧光显微镜成像的全视网膜，使用560±20 nm的激发来检测轴切除RGCs中的乙锭和OH-Et（箭头）。(C类)采用395±5.5 nm的激发，通过外荧光显微镜对全安装视网膜进行成像，以单独检测轴切RGC中的OH-Et（箭头所示）。(**D–I型**)利用CSLO实现OH-Et的共定标体内(**D–F型**)或通过荧光显微镜检查视网膜整体(**G–I型**)用DiR逆行标记RGC。D类和**G公司**，OH-Et，伪红色。E类和**H（H）**，DiR，伪绿色。(F类)中插图的合并图像D类和E类. (我)的合并图像**G公司**和**H（H）**箭头表示位于RGC中的OH-Et。(J型和**K（K）**)罗丹明结合GSL-I染色的小胶质细胞(J型)可以使用检测罗丹明-GSL-I、OH-Et和乙炔的非选择性滤波器组（560±20激发，630±30发射）检测具有特征形态的小胶质细胞（箭头）。HEt的氧化产物（箭头）出现在这张图片上，但定位在焦平面之外。(**K（K）**)在同一场中用选择性滤波器组（395±5.5激发，562±20发射）检测OH-Et阳性J型。小胶质细胞对OH-Et不呈阳性。比例尺：50µm。(我)实验流程图**A–C**,J型和**K（K）**（顶部）。实验流程图**D–I型**（底部）。ONT=视神经横断。

图6
OH-Et可以通过荧光显微镜检测。(A类和B类)在510nm激发的OH-Et（黄色）和乙炔（红色）的发射光谱(A类)和396纳米(B类)，重画自（罗宾逊等。, 2006). (A类)当在510 nm激发时，约40%的OH-Et荧光与乙炔荧光重叠。(B类)当在396 nm激发时，只有10%的OH-Et荧光与乙炔荧光重叠。(C类)OH-Et-选择性过滤器（黄色）和非选择性过滤器（红色）的光谱曲线。后者不能区分OH-Et信号和乙炔信号。(D类)通过X/XO或H氧化HEt的产物成像₂O（运行）₂放在显微镜载玻片上。将OH-Et-选择性（395±5.5 nm）激发滤光片的荧光强度与非选择性560±20 nm激发滤光镜的荧光强度进行了比较。与非选择性过滤器相比，OH-Et-选择性过滤器导致反应产物的荧光发射更多。(E类)经甲萘醌处理的RGC-5细胞通过氧化还原穿梭产生超氧物，与HEt反应。当用1µM或更高浓度的甲萘醌处理时，OH-Et特异性激发导致显著的RGC-5细胞荧光。

图7
Alexa Fluor 488-膜联蛋白V阳性视网膜细胞成像体内视神经切断后CSLO检查。(A类)实验流程图。(B类)CSLO观察视神经横断后膜联蛋白V阳性的时间进程。CSLO的膜联蛋白V阳性在视神经切断后6天达到高峰。(C类)使用CSLO的复合模式对视网膜膜联蛋白V成像的概述。(D类)荧光显微镜下对应的视网膜面积，对应于平方英寸C类Annexin V阳性细胞具有RGC所特有的树突和轴突。ONT=视神经横断。比例尺：20µm。

图8
视神经横断后单个细胞内OH-Et或Alexa Fluor 488-annexin V出现和消失的相对动力学。(A类)HEt实验流程图。(B类)在所研究的124个OH-Et阳性细胞中，73%在<12小时（黑色）呈阳性，27%在12-24小时呈阳性，25%在24-36小时呈阳性(C类)玻璃体内注射HEt后，在眼睛视神经切断后每12小时进行一次纵向视网膜CSLO成像。箭头表示12小时后下一次成像时OH-Et阳性细胞呈阴性，这意味着这些细胞中的超氧物持续时间小于12小时。箭头表示一个OH-Et阳性细胞，在24小时后呈阴性，这意味着该细胞中的超氧物持续时间为12-24小时。(D类)annexin V实验流程图(E类)每隔24小时用Alexa Fluor 488-annexin V对眼睛轴切视网膜进行纵向成像。在分析的250个annexin-V阳性细胞中，分别有43、41和16%在24、24–48和48–72小时内保持阳性。比例尺：20µm。ONT=视神经横断。

图9
(A类)实验流程图。(B类)Alexa Fluor 488-annexin V（绿线）和OH-Et（红线；由Robinson重新绘制）的光谱发射曲线等。, 2006). 黄色区域表示550 nm外部短程滤波器通过并由CSLO传感器检测到的光谱部分（500–650 nm）。红色区域是CSLO传感器检测到的光谱，不带短程滤波器。因此，与Alexa Fluor 488-annexin V相比，当使用550 nm短程滤波器时，OH-Et荧光检测较差。这些结果通过单独注射HEt的大鼠得到了证实。(C类)轴切断后，RGC凋亡之前会产生超氧化物。RGC对OH-Et和annexin V进行双重标记，并在轴切开后4、5和6天进行纵向成像。为了区分Alexa Fluor 488-annexin V发射与OH-Et发射，在有或无短程（550 nm）滤光片的情况下拍摄视网膜CSLO图像。使用短通滤波器，只检测到annexin V（伪绿色）。如果没有短通滤波器，则检测到annexin V和OH-Et（伪红色）。合并显示膜联蛋白V阳性细胞为黄色，OH-Et-阳性细胞为红色。横切后第4天（D4），箭头所示细胞为OH-Et-阳性，第二天（D5）膜联蛋白V-阳性。在横切后第6天（D6），一个细胞变成膜联蛋白V阴性，另一个保持膜联蛋白V阳性。ONT=视神经横断。

**图10**
细胞可渗透聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD）增加SOD-1的细胞内免疫反应性。(A类)实验流程图。(B类和C类)玻璃体内注射平衡盐溶液一天后，视网膜神经节细胞层出现微弱的结构性SOD-1免疫反应。(D类和E类)玻璃体腔内注射PEG-SOD后1天视网膜神经节细胞层有较强的SOD-1免疫反应。C类和E类与含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚复染的图像合并。ONL=外核层；INL=内核层；GCL=神经节细胞层；ONT=视神经横断。比例尺：20µm。

**图11**
细胞渗透性聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD）可减少轴切术后RGC死亡。先前用Alexa Fluor 488-右旋糖酐逆行标记的RGC通过视神经横断进行轴切并进行纵向成像体内. (A类)实验流程图。(B类)未注射视网膜干细胞横断术后与横断前的存活率比较(*n个=*7，白色），眼睛玻璃体内注射平衡盐溶液(n个=8，黑色），眼睛注射PEG-SOD(n个=7，灰色）**P（P）*< 0.05. (C类)使用Alexa Fluor 488-右旋糖酐的RGC系列图像。ONT=视神经切断；D=天。

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