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.2010年5月11日；5（5）：e10589。
doi:10.1371/journal.pone.0010589。

小鼠皮层α-突触核蛋白的活体成像显示其稳定表达和不同的亚细胞室流动性

维韦克·乌尼 1, 泰米莉·A·韦斯曼, 爱德华·罗肯斯坦, 埃利泽·马西利亚, 帕梅拉·麦克林, 布拉德利·海曼
附属公司

小鼠皮层α-突触核蛋白的活体成像显示其稳定表达和不同的亚细胞室流动性

维维克·孔尼等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：细胞内α-同核蛋白水平的调节被认为在帕金森病（PD）发病机制和其他相关的同核蛋白病中起着关键作用。这些过程主要在还原制剂中进行了研究，包括细胞培养。我们现在开发了测量活体哺乳动物大脑中α-同核蛋白水平的方法，以研究具有亚细胞特异性的体内蛋白质迁移、周转和降解。

方法/主要发现：我们开发了一种系统，使用增强型绿色荧光蛋白（GFP）标记的人类α-同核蛋白（Syn-GFP）转基因小鼠和体内多光子成像，以亚细胞分辨率测量α-同核素水平。这一新的实验范式允许在数月的时间内在活体小鼠大脑中对单个Syn-GFP表达神经元和突触前终末进行成像。我们发现，在这个时间框架内，Syn-GFP由神经元和突触前终末稳定表达，并且进一步发现不同的突触前末梢可以表达不同水平的Syn-GFP。使用体内光漂白后荧光恢复（FRAP）技术，我们提供了证据，证明在迁移率低于先前测量值的终端中至少存在两个Syn-GFP池。这些结果表明，在Syn-GFP小鼠中进行多光子成像是探索α-突触核蛋白生物学和神经退行性变相关机制的一种极好的新策略。

结论/意义：Syn-GFP转基因小鼠体内多光子成像显示，皮层神经元内α-同核蛋白表达稳定，亚细胞间室运动差异。这为研究活体大脑中的α-同核蛋白生物学以及测试帕金森病和相关疾病的新疗法开辟了新途径。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Syn-GFP存在于神经元细胞体和突触前终末。
A.大脑皮层Syn-GFP的固定组织共焦图像显示一个神经元胞体，绝大多数神经膜点状染色存在于轴突内。内源性GFP荧光显示无抗体标记。B。体内皮质中Syn-GFP的多光子图像显示一个神经元胞体和多个神经纤毛点染色。A–B的比例尺为10µm。C.Syn-GFP动物皮层的固定组织共焦图像，显示两个躯体和神经膜中的GFP染色。D.人α-突触核蛋白的同一切片染色。E.合并后的图像显示GFP信号和人类α-突触核蛋白之间的共定位，正如该融合蛋白所预期的那样。C–E 20µm的比例尺。
图2
图2。Syn-GFP阳性细胞体和突触前终末密度不随年龄变化。
A.不同年龄皮质2/3层的平均Syn-GFP阳性细胞体密度的组数据表明，不同年龄的Syn-GFP阳性细胞体密度没有差异。B.不同年龄组大脑皮层2/3层Syn-GFP阳性突触前终末平均密度的分组数据显示，与年龄无关。C.平均终末强度的代表性直方图（以任意单位表示）在三个不同年龄段显示出相似的形状。n=动物数量，误差条=1 SD。
图3
图3。Syn-GFP细胞体和高强度突触前终末表达随时间相对稳定。
体内同一区域在2个不同时间点（A1：第0天，A2：第49天）的多光子图像显示，Syn-GFP细胞体的表达在数周内保持稳定。箭头显示两个时间点都存在的4个细胞Syn-GFP阳性体。A1-2 10µm的比例尺。体内在不同时间点重复成像的两个不同区域（B1-3和C1-4）的多光子图像表明，高强度Syn-GFP末端表达可以持续数月。箭头显示所有时间点都存在的多个Syn-GFP正极端子，箭头显示随着时间推移消失的高强度端子。B 10µm和C 7.5µm的比例尺。
图4
图4。Syn-GFP表达模式、细胞体和末端密度不随时间窗后位置变化。
体内窗口放置后3个不同时间（A:0天，B:3个月，C:6个月）大脑皮层Syn-GFP的多光子图像显示出类似的染色模式。比例尺10µm。D.窗口放置后不同时间大脑皮层2/3层Syn-GFP阳性细胞平均体密度的分组数据无显著差异。E.窗后不同时间大脑皮层2/3层突触前前叶平均Syn-GFP阳性终末密度的组间数据无显著差异。F.平均终点强度的代表性直方图（以任意单位表示）在窗口放置后的不同时间显示出类似的形状。n=动物数量，误差条=1 SD。
图5
图5。Syn-GFP突触前终末信号在光漂白后恢复不同。
答：。体内Syn-GFP阳性终末同一区域随时间变化的多光子图像。t=0后，一个正常端子（用白色圆圈标记）被光漂白。该序列显示Syn-GFP信号在几分钟内完全恢复。B.与面板A中的时间序列类似，但在这种情况下，一个高强度终端（用白色圆圈标记）在t=0后被光漂白。该序列显示Syn-GFP信号的部分恢复。比例尺A和B 5µm。C.绘制突触前末端光漂白前后归一化荧光的组数据（用黄色箭头标记；正常末端n=15末端，高强度末端n=10末端；n=5只动物，误差条=1 SD；*表示在t=8min时的统计显著差异，t检验p<0.0001）。
图6
图6。Syn-GFP体细胞信号在全细胞光漂白后恢复缓慢，在半细胞光漂白期间快速移动。
答：。体内Syn-GFP阳性细胞体同一区域随时间变化的多光子图像。一个躯体（用白色圆圈标记）在t=0后立即进行光漂白。该序列显示Syn-GFP信号在60分钟内部分恢复。B的时间序列与面板A中的时间序列相似，但在这种情况下，一半躯体（用白矩形标记）在t=0后立即光漂白。A中的标尺为10µm，B中的标杆为20µm。C.绘制光漂白前后归一化荧光的组数据（用黄色箭头标记；全细胞漂白剂：n=20个细胞，半细胞漂白剂：n=3个细胞；n=3只动物，误差条=1 SD）。
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参考文献

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