Inhibition of pulmonary fibrosis in mice by CXCL10 requires glycosaminoglycan binding and syndecan-4

doi:10.1172/JCI38644

.2010年6月；120(6):2049-57.

doi:10.1172/JCI38644。 Epub 2010年5月17日。

CXCL10抑制小鼠肺纤维化需要糖胺聚糖结合和syndecan-4

姜殿华¹, 梁九荣, 加布里埃尔·S·坎帕内拉, 郭日淑, 双宇, 谢婷（Ting Xie）, 刘宁山, Yoosun Jung（柳森·荣格）, 罗伯特·霍默, 埃里克·B·梅尔泽, 李月娟, 安德鲁·M·塔格, 保罗·F·戈廷克, 安德鲁·德·卢斯特, 保罗·W·诺布尔

附属机构

PMID： 20484822
预防性维修识别码：项目经理2877927
DOI（操作界面）： 2017年10月17日/JCI38644

CXCL10抑制小鼠肺纤维化需要糖胺聚糖结合和syndecan-4

姜殿华等人。临床研究杂志. 2010年6月.

.2010年6月；120(6):2049-57.

doi:10.1172/JCI38644。 Epub 2010年5月17日。

作者

附属

¹美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院医学系肺、过敏和危重病护理医学部，邮编27710。dianhua.jiang@duke.edu

PMID： 20484822
预防性维修识别码：项目经理2877927
DOI（操作界面）： 2017年10月17日/JCI38644

摘要

肺纤维化是一种对损伤的渐进性、失调性反应，由于过度的细胞外基质生成，最终导致肺功能受损。硫酸乙酰肝素蛋白多糖syndecan-4在介导成纤维细胞-基质相互作用中很重要，但其在肺纤维化中的作用尚未被探索。为了研究这个问题，我们采用气管内滴注博莱霉素作为急性肺损伤和纤维化的模型。我们发现博莱霉素治疗增加了syndecan-4的表达。此外，我们观察到博莱霉素治疗的syndecan-4-null（Sdc4-/-）小鼠中性粒细胞募集显著减少，肌成纤维细胞募集和间质纤维化增加。随后，我们确定了抗纤维化趋化因子CXCL10和syndecan-4之间的直接相互作用，syndecan-4在纤维化期间抑制原发性肺成纤维细胞的迁移；CXCL10的肝素结合域（而非CXCR3域）的突变减弱了这种作用。同样，在CXCR3结合缺陷的CXCL10蛋白存在的情况下，肺纤维化患者成纤维细胞的迁移受到抑制。此外，注射重组CXCL10蛋白可以抑制WT小鼠的纤维化，但在Sdc4-/-小鼠中没有。总之，这些数据表明，syndecan-4和CXCL10在肺间质室中的直接相互作用有助于抑制成纤维细胞的募集和随后的纤维化。因此，给予CXCR3结合缺陷的CXCL10蛋白可能是一种新的肺纤维化治疗方法。

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数字

**图1。非感染性肺损伤诱导syndecan-4表达。**
(A类)*Sdc4公司*博莱霉素诱导的肺损伤上调了mRNA表达。给C57BL/6小鼠气管内注射博莱霉素或生理盐水，并在损伤后1、3和7天取肺。通过RT-PCR评估肺组织中的mRNA水平(n个=3–4）。(B类)博莱霉素诱导损伤后7天，肺组织Syndecan-4细胞表面表达上调。C57BL/6小鼠气管内注射博莱霉素，伤后7天取肺，通过Dispase II和DNase I消化分离单个细胞。通过用syndecan-4特异性抗体染色细胞来测定syndecan-4的细胞表面表达(n个=6[未经处理]；9[博莱霉素]）。流图显示syndecan-4在总活细胞和白细胞（CD45）上的表达受到门控⁺). 从未经处理（Ctl）或用博莱霉素（Bleo）处理7天的小鼠肺组织中分离的成纤维细胞也被syndecan-4染色。对照IgG阴性染色显示为绿色。

**图2。肺纤维化增加*Sdc4公司^–/–*老鼠。**
(A类)*Sdc4公司^–/–*和窝友WT对照组受博莱霉素诱导的肺损伤影响。伤后14天和21天测定肺中羟脯氨酸含量(n个= 5–10). 数据是3个类似实验的代表。(B类)肺切片*Sdc4公司^–/–*伤后21天，WT小鼠用三色和抗α-SMA染色，胶原染色增强，α-SMA表达增加*Sdc4公司^–/–*老鼠(n个= 7). 原始放大倍数，×100。(C类)肺切片*Sdc4公司^–/–*伤前、伤后14天和21天，对WT小鼠进行I型胶原染色，结果显示肺组织中I型胶原的染色增加*Sdc4公司^–/–*老鼠(n个= 7). 原始放大倍数，×100。

**图3。炎症调节异常*Sdc4公司^–/–*博莱霉素致小鼠肺损伤。**
(A类)*Sdc4公司^–/–*博莱霉素诱导的肺损伤后21天内，小鼠BAL中的总炎症细胞增加。(B类–E类)细胞总数的增加是巨噬细胞增加的结果(B类)和淋巴细胞(E类). (C类和D类)中性粒细胞也减少。(A类–E类)n个= 5–7. **P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01. 在3个单独的实验中获得了类似的结果。

**图4。外源性CXCL10不能抑制*Sdc4公司^–/–*老鼠。**
*Sdc4公司^–/–*和窝友WT对照组受博莱霉素诱导的肺损伤影响。从受伤当天起，每天肌肉注射重组小鼠CXCL10或BSA缓冲液。伤后13天测定肺中羟脯氨酸含量(n个= 8–9).

**图5。更多成纤维细胞染色*Sdc4公司^–/–*与WT小鼠肺部的对比。**
肺切片*Sdc4公司^–/–*用成纤维细胞标记物ER-TR7对博莱霉素损伤前、损伤后14天和21天的同窝WT小鼠进行染色，发现肺组织中成纤维细胞染色增加*Sdc4公司^–/–*老鼠(n个= 7). 原始放大倍数，×100。

**图6。CXCL10与syndecan-4结合。**
(A类)从WT肺组织中分离出的细胞数量相等，*Sdc4公司^–/–*、和*Cxcr3号机组^–/–*小鼠与¹²⁵标有I的CXCL10。清洗后，测量总放射性标记活性。减少的绑定¹²⁵I标记的CXCL10到*Sdc4公司^–/–*和*Cxcr3号机组^–/–*观察到细胞(n个= 3). 从3个实验中获得了类似的结果。(B类)从WT肺组织中分离出等量的成纤维细胞，*Sdc4公司^–/–*、和*Cxcr3号机组^–/–*小鼠与¹²⁵标有I的CXCL10。减少的绑定¹²⁵I标记的CXCL10到*Sdc4公司^–/–*观察到成纤维细胞(n个= 4). 从3个实验中获得了类似的结果。(C类)CXCL10与成纤维细胞的结合。将WT肺组织中含Syndecan-4的成纤维细胞在24孔板中汇合，并用¹²⁵I标记的CXCL10和在4°C下增加未标记CXCL10的浓度。金额¹²⁵与细胞结合的I-CXCL10显示为在没有未标记CXLC10的情况下的百分比。(D类)将CXCL10交联到syndecan-4。生物素标记的CXCL10（0.5μg）与肺组织匀浆在存在或不存在过量未标记CXCL10的情况下孵育，并与DSS交联，然后是IP与syndecan-4特异性抗体。用链霉亲和素HRP观察到与生物素化CXCL10交联的新癸烷-4，然后进行增强化学发光。箭头表示CXCL10–syndecan-4复合物。

**图7。CXCL10对BAL诱导的成纤维细胞趋化性的抑制需要syndecan-4。**
(A类)肺成纤维细胞分离自*Sdc4公司^–/–*和室友对照小鼠，并将其置于纤维连接蛋白涂层的Boyden小室中，小室孔径为8μm。博莱霉素损伤5天后，将来自WT小鼠的BAL添加到底部腔室。对于某些组，还将重组CXCL10（500 pg/ml）添加到顶部和底部室中(n个= 12–14). 原始放大倍数，×100。从5个实验中获得了类似的结果。(B类)成纤维细胞迁移的定量。用40倍物镜在光学显微镜下对每片5个视野的成纤维细胞进行计数。5个区域的成纤维细胞总数表示为迁移指数(n个= 3–5). (C类)肺成纤维细胞分离自*Cxcr3号机组^–/–*老鼠和电镀到博伊登室。博莱霉素损伤5天后，将来自WT小鼠的BAL添加到底部腔室。对于某些组，重组CXCL10也被添加到顶部和底部腔室中。在显微镜下用一个×40物镜观察4个视野中的成纤维细胞总数作为迁移指数(n个= 4).

**图8。CXCL10蛋白的GAG结合位点在抑制BAL诱导的成纤维细胞趋化性中的关键作用。**
从WT小鼠中分离出肺成纤维细胞(A类–C类)或来自肺纤维化患者(D类)镀在Boyden室上，并按以下详细说明进行处理。用40倍物镜显微镜定量成纤维细胞迁移，每片4个区域计数成纤维细胞(n个=每组4人）。数据表示为迁移索引。(A类和B类)将博莱霉素损伤后5天WT小鼠的BAL添加到底部腔室；对于某些组，还将重组天然CXCL10、CXCL10突变体R8A和CtR22A或硫酸乙酰肝素（HS）添加到顶部和底部室中。(C类)一些成纤维细胞在迁移试验前用肝素酶处理2小时。BAL被添加到底部腔室，CXCL10被添加到顶部和底部腔室。(D类)用CXCL10、R8A或CtR22A治疗从肺纤维化患者分离的肺成纤维细胞。从3名不同的IPF患者分离的肺成纤维细胞也获得了类似的结果。

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1. Noble PW，Homer RJ。特发性肺纤维化：发病机制的新见解。《临床胸科医学》2004；25（4）：749–758，vii。doi:10.1016/j.ccm.2004.04.003。-内政部-公共医学
1. Kuwano K等。Fas-Fas配体途径在肺纤维化发展中的重要作用。临床投资杂志。1999;104(1):13–19. doi:10.1172/JCI5628。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Ramos C等。特发性肺纤维化和正常肺的成纤维细胞在生长速度、凋亡和金属蛋白酶组织抑制剂表达方面存在差异。美国呼吸细胞分子生物学杂志。2001;24(5):591–598.-公共医学
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