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.2010年8月；84(15):7543-57.
doi:10.1128/JVI.00477-10。 Epub 2010年5月19日。

Semliki森林病毒复制复合物从质膜到修饰溶酶体的磷脂酰肌醇3-激酶、肌动蛋白和微管依赖性转运

皮尔乔·斯普乌尔（Pirjo Spuul） 1, 朱塞佩·巴利斯特里, Leevi Kaäriäinen, 特罗·阿霍拉
附属公司

Semliki森林病毒复制复合物从质膜到修饰溶酶体的磷脂酰肌醇3-激酶、肌动蛋白和微管依赖性转运

皮尔乔·斯普乌尔（Pirjo Spuul）等。 J维罗尔. 2010年8月.

摘要

与其他阳性RNA病毒一样，α病毒通过修饰细胞膜复制基因组。阿尔法病毒复制位点由许多球状膜内陷（球体）组成，其中包含双链复制中间产物。利用Semliki Forest病毒（SFV）感染细胞进行的时间进程研究，结合活细胞成像和电子显微镜，揭示了SFV复制复合体球体在细胞室之间发生了前所未有的大规模移动。球状物首先在质膜上积聚，然后通过内吞过程内化，这需要一个功能性肌动蛋白网络，如blebbistatin治疗所示。Wortmanin和其他抑制剂表明，球体的内化还需要磷脂酰肌醇3-激酶的活性。因此，球体代表一种不寻常的内吞物质。内吞作用后，含有球状小泡的小泡具有高度的动态性，pH值为中性。这些初级载体与酸性内体融合，并在微管上以诺克唑阻止的方式进行长距离移动。大规模迁移的结果是形成了一个非常稳定的隔间，球状物聚集在位于中心点附近的异常大的静态酸性液泡的外表面。我们的工作强调了导致被不同组阳性RNA病毒感染的细胞膜室发生改变的过程中的基本相似性和重要差异。

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图1。
图1。
SFV感染的复制方案和时间进程。（A） SFV基因组和ns蛋白表达的示意图。显示了单个ns蛋白的主要功能。（B） 通过dsRNA中间产物的SFV RNA复制策略。虽然复制中间产物显示为完全双链，但dsRNA的实际范围尚不清楚。（C） 复制诱导膜结构或球体的模型，复制酶蛋白显示在颈部，dsRNA分子位于球体内部。新合成的阳性RNA被释放到细胞质中。蛋白质没有显示成鳞片。复制蛋白的多个拷贝可以定位在整个球体中（24）。（D） SFV RC在时间进程中的本地化。BHK细胞以每细胞50 PFU的速度模拟感染或感染SFV，并在指定的时间点固定样本。用抗nsP3（绿色）和抗dsRNA（红色）抗体检测RCs。Colocalization（黄色）表示活动RC。用共焦显微镜对样品进行了分析，并显示了细胞中部的代表性光学切片。还提供了每个单元格的总分段数（秒）。（a） 模拟感染样本。（b和c）固定在1小时30分钟（b）和2小时（c）的样品显示，RC在PM处积聚。（d）与面板c对应的EM横截面显示了PM处的球体。（插图）PM外表面的病毒颗粒（左侧）大小相似，但在形态上与球体（右侧）不同。（e和f）对于固定在2 h 30 min的样品，显示了中间（e）和底部（f）截面。（g和h）4小时（g）和8小时（h）固定的样本图像显示了核周CPV的晚期表型。棒材，共焦显微镜图像为10μm，EM图像为200 nm。（E） 目视分析。根据RCs在感染500个PFU/细胞的时间过程中的定位来定义表型。在每个时间点，随机选择每张盖玻片的5个区域的图像，每个区域标记大约100个细胞。根据RCs的定位模式，细胞分为三种表型类型：早期（PM染色）、中期（PM染色和小RC-小泡）和晚期（较大的核周RC-小囊泡[CPV-I]）。
图2。
图2。
PI3K参与RCs的贩运。（A） 沃特曼在PM处阻断RCs。通过正交光学切片分析未处理细胞和用100 nM沃特曼处理的细胞。在未经处理的样本中，dsRNA-阳性CPV（绿色）位于核周区，但沃特曼抑制RCs的内化。肌动蛋白与卵磷脂-AF568（红色）染色显示细胞轮廓。棒材，10μm。（B） 平行样品通过扫描电子显微镜进行分析。（a） 未经处理的样品在4小时p.i.时显示出一个透明的颗粒物，几乎没有小球。（b）在沃特曼处理的样品中，颗粒物中充满了小球。（c） 高倍放大从处理样品的相邻区域获得的区域，显示球状物成簇出现。（C） 与未经处理样品中的RCs定位相比，在100 nM沃特曼、50μM LY294002或200 nM PI-103存在下对RCs定位进行量化。对来自四个场的受感染细胞（n表示分析的细胞总数）进行定量以进行RC定位。误差条表示SD。
图3。
图3。
SFV-ZsG在固定细胞和活细胞中的复制分析。（A） （上图）SFV-ZsG基因组示意图。突出显示ZsG序列的插入。（底部）将SFV-ZsG的生长曲线与wt SFV4病毒的生长曲线进行比较。BHK细胞感染10个PFU/细胞，每2小时取一等分样品，通过斑块试验测定滴定度（PFU/ml）。10小时后，对细胞进行裂解，并用抗nsP3抗体对样品进行免疫印迹分析，以验证是否存在融合蛋白nsP3-ZsG（如插图所示）。（B） 感染早期含有ZsG的RCs的PM定位。BHK细胞以500 PFU/细胞的速度感染SFV-ZsG，并在2 h p.i固定。使用抗dsRNA抗体（红色）确认复制复合物中存在ZsG。图中显示了具有代表性的共焦截面。左侧和中间面板中方框中的区域在右侧以较高的放大倍数显示，并显示dsRNA和ZsG信号的共定位。棒材，10μm（左和中）和5μm（右）。（C） 用相关光电子显微镜（CLEM）研究细胞底部的RCs。BHK细胞被SFV-ZsG VRPs（MOI，500）感染，在每次2小时30分钟时，用戊二醛固定细胞。（a） 用共焦显微镜对一个有代表性的感染细胞成像（插图为绿色）。用EM重新定位同一个细胞，并分析第一个水平截面（sec 1）。（b） 同一个细胞的高倍放大显示，细胞底部有大量球体。棒材，1μm。（c） 图b放大倍数更高，显示了与核衣壳不同的球状簇（白色箭头）（黑色箭头）。条形，200 nm。（D） 感染SFV-ZsG VRP的BHK细胞的活细胞成像（MOI，500）。LysoTracker（红色）显示细胞酸性室。在下午4小时用共焦显微镜拍摄图像。显示了整个单元的三维重建（参见材料和方法）。条形，10μm（左侧和中央面板）和3μm（最右侧面板）。
图4。
图4。
感染不同阶段RCs的细胞内动力学。（A和B）感染SFV-ZSG VRP的BHK细胞的共焦活细胞成像（MOI，500）。LysoTracker（红色）突出酸性细胞器。显示了六个ZsG阳性囊泡的追踪。各个囊泡在分割的通道（顶部）和合并的图像（左下角）中圈出；这些图像代表了录制的第一帧。曲目根据时间进行颜色编码，如图像所示。棒材，5μm。记录速率为0.5帧/秒（0.5赫兹）。（A） 感染早期（每次2小时30分钟）RCs的不同动态。轨道1至5代表I类运动，轨道6代表II类运动。注意，只有囊泡6是酸性的。总记录时间为5分钟21秒。（B）感染晚期（每次4小时）RCs的动态。轨迹1和2（III型）显示了晚期酸性ZsG-阳性囊泡（CPV-I）的运动，这些囊泡大多是不动的。轨迹3和轨迹4显示了非酸性（I型）小RC-小泡的运动，轨迹5和轨迹6显示了定向长距离II型动力学。囊泡5在录制过程中变酸，囊泡6在电影开始时已经呈酸性（参见补充材料中的视频S3）。总记录时间为4分钟40秒。（C）I类（轨道A1）、II类（轨道A6）和III类（轨道B1）运动的代表性轨迹图。记录期间的速度变化如图所示。（D） SFV感染周期中RC-阳性小泡的三种运动汇总表。显示轨道位移、最大和平均速度；根据六条轨迹计算SDs。（E） 感染SFV-ZSG VRP（MOI，500）的BHK细胞在p.i.3小时的活细胞成像（见补充材料中的视频S4）。LysoTracker（红色）突出细胞酸性细胞器。在7 min 35 s内以1帧/s（1 Hz）的速率记录帧。在时间零点显示分割通道（左上下面板）；否则，将显示合并图像。箭头表示早期ZsG-阳性囊泡（非酸性）与先前存在的酸性细胞器的快速融合，并跟随其向近中心点区域的长距离移动。在同一部电影中，两个CPV的缓慢融合由圆形区域表示。棒材，3μm。
图5：。
图5：。
肌动蛋白网络在感染早期被利用。（A） RCs沿着肌动蛋白纤维的方向排列在细胞底部。BHK细胞感染SFV（MOI，50）并在2 h 30 min p.i固定。RCs用抗nsP3抗体（绿色）染色，肌动蛋白用指骨苷-AF568（红色）染色。棒，10μm。在最右侧的面板中，方框区域以更高的放大率显示。（B） Blebbistatin可冻结活细胞中RCs的所有运动。BHK细胞感染SFV-ZsG VRPs（MOI，500），并在每次2小时30分钟时添加30 nM的布利司他丁。在添加药物后2分钟开始成像。显示了具有代表性的轨迹（右图）。记录速率为0.5帧/秒（0.5赫兹）。总录制时间为3分钟44秒。图像代表录制的第一帧。棒材，5μm。（C） （左）小泡的轨迹在面板B中圈出（暴露于镇静剂2分钟后）。（右）10分钟内使用镇静剂治疗后的轨迹。在这些图表下，显示了六条具有代表性的轨道的统计数据。（D） Blebbistatin治疗延迟了RCs的向内运动和CPV的成熟。用SFV（MOI，500）感染BHK细胞，并在1小时30分钟p.i时加入30nM blebbistatin。在4小时p.i时固定样品，并用抗dsRNA抗体（绿色）和鬼笔肽-AF568（红色）染色。（E） RCs的定位在四个字段中进行了量化（n表示分析的细胞总数），并与未经处理的样本进行了比较。误差条代表两个独立实验的SD。（F） 感染后期肌动蛋白破坏。BHK细胞感染了SFV（MOI，50），并在6 h p.i.固定。样品按照面板A所述进行染色。最右边的面板以更高的放大倍数显示装箱区域，显示了病毒诱导的含有肌动蛋白的丝状延伸。棒材，10μm。
图6。
图6。
微管参与CPV向核周区的转运。（A至C）SFV感染细胞的共聚焦活细胞成像，无论是未经治疗的还是在诺康唑存在的情况下（从感染开始）。BHK细胞感染SFV-ZsG VRPs（MOI，500），于4小时后进行成像。用LysoTracker（红色）染色酸性细胞器。（A） （左）未处理样品，显示晚期表型和酸性细胞器周围的ZsG信号。（右）左侧框选区域的等参面表示。将CPV切成两半，以显示LysoTracker染色周围的ZsG信号。（插图）装箱区域的CPV完好无损，隐藏LysoTracker信号。（B） （左）在诺卡唑存在下，含有RC-的小泡保持分散状态。它们不被转运到核周区，只有一些ZsG信号与LysoTracker共定位为酸性细胞器表面的小斑块。选择用实线框起的区域用于等值面表示，而用虚线框起来的区域用于跟踪面板C Bar中的RC，10μm。（右）等参面表示。棒材，1μm。（C） 跟踪诺可唑处理样品中的RCs。记录速率为0.5帧/秒（0.5赫兹）。总录制时间为1分钟36秒。显示了典型曲目；右侧给出了一条轨道（带圆圈）的统计数据。棒材，5μm。（D） 诺卡唑治疗不会干扰SFV的复制。BHK细胞在诺克唑存在下感染SFV（MOI，500），细胞在4h p.i.固定。分散的nsP3阳性小泡（绿色）也对dsRNA染色呈阳性（红色）。棒材，10μm。
图7。
图7。
抑制剂存在下的病毒复制。显示了SFV-ZsG在沃特曼或诺卡唑存在下的一步生长曲线。如图所示，每隔2小时取出释放的病毒，并用直接荧光法测定病毒滴度（见材料和方法）。（插图）相同抑制剂对SFV RNA合成的影响。感染的BHK细胞被脉冲标记为[三H] 尿苷和标记RNA在TCA沉淀后通过闪烁计数进行测量。结果是两个独立实验的平均值；误差条表示SD。
图8。
图8。
α病毒RC的运输和CPV-I的生物发生模型。在通过网格蛋白介导的内吞作用进入SFV后，低pH触发的融合释放核衣壳，病毒mRNA被翻译成多蛋白。蛋白质-RNA复合物通过未知机制（白色箭头）运输到PM。在PM，形成球状结构（步骤1），然后以PI3K（沃特曼抑制）和肌动蛋白（布利司他丁抑制）依赖性方式内吞。小的内化囊泡携带一些球状物（步骤2），发生许多同型融合以及与晚期内体的融合（步骤3[诺康唑抑制]）。这些较大的、酸性的、含RC-的小泡通过使用微管（诺卡唑抑制）被运输到核周区域，在那里完成稳定的大CPV-I的成熟（步骤4）。晚期囊泡的酸性由粉红色表示。，沃特曼；EE，早期内体；LE，晚期内体。模型右侧显示了RC贩运每一步的代表性EM图像。
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