跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2010年5月14日；141(4):656-67.
doi:10.1016/j.cell.2010.04.009。

饥饿期间自噬体生物发生的线粒体供应膜

戴尔·W·海利 1, 安吉丽卡·S·兰博尔德, 普拉桑纳·萨普特·克里希南, 卡斯图里密特拉, 拉希德·苏格拉特, 彼得·K·金, 詹妮弗·利平科特·施瓦茨
附属公司

饥饿期间线粒体为自噬体生物生成提供膜

戴尔·W·海利等。 单元格. .

摘要

饥饿诱导的自噬体吞噬细胞质和/或细胞器，并将其传递到溶酶体进行降解，从而重新补充耗尽的营养。尽管在理解这一过程的分子基础方面取得了进展，但自噬体的膜起源仍不清楚。在这里，我们证明，在饥饿的细胞中，线粒体的外膜参与自噬体的生物发生。早期自噬体标记Atg5暂时定位于线粒体上的点状突起，随后是晚期自噬标记LC3。线粒体外膜蛋白的尾锚也标记自噬体，足以将另一个线粒体外膜蛋白质Fis1传递到自噬体内。荧光脂质NBD-PS（在线粒体中转化为NBD-磷酸二乙醇胺）从线粒体转移到自噬体。光漂白显示线粒体和自噬体的膜暂时共享。线粒体融合蛋白2耗竭导致线粒体/ER连接中断，从而显著损害饥饿诱导的自噬。因此，线粒体在饥饿诱导的自噬中起着核心作用，为自噬体提供膜。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。饥饿诱导自噬体形成的特征
（A）饥饿NRK58B细胞的时间跨度活细胞成像。转用饥饿培养基后，CFP-LC3阳性结构迅速增殖。注意CFP-LC3的细胞溶质和核池同时耗竭。生长培养基（时间0）替换为饥饿培养基（后续面板）。（比例尺：20μm）（B）CFP-LC3阳性结构的量化。自噬体在连续的延时框架中计数，并绘制成饥饿介质中时间的函数。数据点显示20个单元格的平均值；错误栏显示1 SD（C）用III类PI（3）激酶抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）治疗。CFP-LC3结构的稳健形成需要激酶的活性。相同的水井在3-MA存在下未经处理、饥饿或饥饿2小时（三个左面板）。随后，用3-MA处理的饥饿细胞被清洗，在DPBS中孵育，并在2小时后成像（右侧面板）。3-MA治疗消除了CFP-LC3向细胞膜的募集以及细胞溶质和核池的耗竭（2第从右侧）。3-MA的洗脱恢复了细胞在饥饿期间诱导自噬体形成的能力。（比例尺：20μm）（D）3-MA处理的量化（20个细胞的平均值+/-1 SD）。通过Student t检验，条形图中的星号表示治疗与未治疗细胞在统计学上存在差异：p值<0.001。（E）表达YFP-mApg5的NRK58B细胞的延时活细胞成像。在饥饿期间，出现了YFP-mApg5 puntae，随后招募了CFP-LC3并释放了YFP-mApg5。箭头表示两个示例。插图用右下箭头表示自噬体的放大。另请参阅补充电影1。（比例尺：嵌入2μm；面板10μm）（F）延时帧中YFP-mApg5和CFP-LC3信号的量化。YFP-mApg5的显著积累总是在CFP-LC3招募之前。YFP-mApg5持续<4分钟并突然释放。（G）自噬体形成的定位。饥饿期间，CFP-LC3募集前短暂出现的YFP-mApg5点状突起散布在整个细胞液中。（比例尺：5μm）（H）鉴定饥饿诱导的自噬体中细胞溶质蛋白的捕获。面板区域外的重复光漂白耗尽了自由扩散信号。这种缺失揭示了在CFP-LC3标记结构中捕获的GAPDH-YFP亚群。（比例尺：2μm）。
图2
图2。描述饥饿诱导的自噬体的命运
（A）可视化自噬体与溶酶体的融合。NRK58B细胞饥饿，随后用细胞渗透性重要溶酶体标记物标记。活细胞成像显示自噬体和溶酶体之间的融合事件，导致溶酶体标记物的积累和自溶体CFP-LC3信号的同时丢失（箭头所示）。另请参阅补充电影2。（B）通过光脉冲标记和活细胞成像观察自噬体的周转。饥饿2小时后，PAGFP-LC3细胞被光激活，细胞溶质激活信号耗尽，以脉冲标记现有的自噬体群体（左上图）。活细胞成像显示，脉冲标记的人群随时间而消失（顶部面板；另请参阅补充电影3），而氯喹的加入阻止了这种消失。（C）结构寿命的量化。注意，饥饿诱导的自噬体的转换效率出奇地高：t1/2约25分钟。
图3
图3。评估外源性膜靶向标记物转移到自噬体
（A）饥饿诱导NRK58B细胞中嵌合YFP膜标记物的表达。靶向细胞内膜系统的嵌合YFP标记在NRK58B细胞中表达（从左至右显示：早期内体系统、高尔基体、反高尔基体网络、ER和线粒体外膜）。线粒体外膜标志物YFP-Mito立方厘米5TM，独特地与诱导的自噬体共定位。（比例尺：15μm）（B）量化CFP-LC3信号与膜标记信号的重叠。对于每个标记物，对CFP信号与YFP信号重叠超过25%的自噬体进行计数；这个数字除以自噬小体的总数，以确定与标记物重叠的自噬体总数的百分比。二十个单元格的平均值显示为+/-1 SD。（C）YFP-Mito的稳定性评估立方厘米5TM在自噬体膜上。YFP-Mito公司立方厘米5鉴定出TM-阳性自噬体。YFP-Mito公司立方厘米5随后，TM在细胞的其余部分被漂白（右上角的散列线表示的光漂白区域）。未漂白YFP-Mito煤层气5TM信号持续存在于自噬体上（时间序列以秒为单位，下表）。（比例尺：10μm上面板；1.5μm下面板）
图4
图4。评估有丝分裂是否是YFP-Mito出现的基础立方厘米5自噬体上的TM
（A）比较CFP-LC3信号与线粒体外膜（MOM）、内膜和基质信号重叠。表达MOM、内膜和基质标记物的NRK58B细胞的高分辨率成像显示，CFP-LC3信号与外膜强烈重叠，但与内膜和基体标记物无关（见箭头）。（B）用线粒体标记物量化CFP-LC3信号重叠。量化如图3B所示。(C类)YFP-Mito协会评估立方厘米5TM与自噬体膜结合。YFP-Mito联合转染NRK58B细胞立方厘米5TM和GAPDH-RFP，挨饿。通过光漂白去除自由扩散的GAPDH-RFP的信号，以显示CFP-LC3/YFP-Mito煤层气5TM/GAPDH-RFP阳性自噬体。这些结构的高分辨率图像显示YFP-Mito煤层气5TM存在于膜上，而不是滞留在管腔中。（比例尺：1.5μm）（D）CFP-LC3/YFP-Mito的线扫描评估立方厘米5自噬体中的TM/GAPDH-RFP信号。沿着横切线（如a所示）的CFP-LC3和YFP-Mitocb5TM像素值显示了两个描绘的峰（膜）。相反，沿着这条线的GAPDH-RFP像素值显示了一个钟形信号（流明）。
图5
图5。评估饥饿诱导的自噬体和线粒体的相关性
（A）GFP-LC3标记的自噬体和相关线粒体元件的活细胞成像。用线粒体基质标记Mito RFP和自噬体标记GFP-LC3转染NRK细胞。饥饿细胞的高分辨率高速成像显示，自噬体在与线粒体元件紧密结合的过程中生长。另请参阅补充电影4。（B）饥饿细胞的电子显微镜。电子显微照片显示，存在与排除线粒体基质的线粒体元件紧密相关的多臂结构。虽然在饥饿细胞中罕见，但在未弯曲细胞中从未观察到这些结构。（C）用CFP金结合抗体标记的饥饿NRK58B细胞的免疫电镜显示，金颗粒簇与近端线粒体元件紧密相关。（D）展示自噬体/线粒体膜关联分析的模型。线粒体元件末端的光漂白耗尽所有YFP-Mito立方厘米5TM信号在整个膜中扩散。一个YFP-Mito立方厘米5膜与MOM连续的TM阳性自噬体也失去YFP-Mito立方厘米5TM信号通过两个相关细胞器之间的扩散传递。一个YFP-Mito立方厘米5TM阳性自噬体与MOM接近但不连续，保留YFP-Mito立方厘米5TM信号。（E）数据显示自噬体/线粒体膜的连续性。鉴定出与线粒体元件相关的自噬体。用405nm和490nm光（黄色方框）靶向相关线粒体元件的远端。这里，由于标记物从靶区外扩散到靶区，远端光漂白耗尽了来自线粒体和漂白区外相关自噬体的信号。（请参阅中间面板底部行的信号丢失）。（比例尺：2μm）（F）近端线粒体元件光漂白后，空间上接近但不相关的自噬体保留信号（见中排底线信号保留）。（比例尺：2μm）
图6
图6。线粒体脂质在自噬体形成中的利用
（A）加载外源性NBD-磷脂酰丝氨酸（NBD-PS）后的时间进程。NRK细胞暴露于220μM NBD-PS，随后清洗，并保存在完整的培养基中。NBD信号在线粒体中迅速积累；4小时后，大部分NBD信号丢失。（比例尺：5μm）（B）NBD-PS染色和线粒体标记。线粒体追踪器红和NBD-PS的高分辨率成像显示，外源性NBD-PS加载一小时后，线粒体中NBD-PS信号积累。（C）饥饿诱导自噬体的NBD标记。用NBD-PS标记细胞，让NBD在饥饿前1小时积聚在线粒体中。饥饿后，NBD信号在诱导的（mCherry-LC3阳性）自噬体中积累。（比例尺：5μM）（D）线粒体2缺陷导致ER-mitochondria连接中断。Mfn2公司+/+和Mfn2−/−用人mCherry-LC3转染MEF细胞。Mfn2公司+/+和Mfn2−/−在营养丰富的饥饿条件下，细胞表现出相似程度的基础自噬。饥饿后，Mfn2−/−细胞不能诱导自噬。Mfn2公司+/+细胞自噬结构数量急剧增加，在饥饿条件下，mcherry-LC3的细胞质和核池耗竭。Mfn2公司−/−细胞（如3-MA处理的细胞）不能诱导更多的自噬体，也不能清除胞浆和核mCherry-LC3。（E）Mfn2中mCherry-LC3阳性结构的定量+/+和Mfn2−/−细胞。在三个独立的实验中，对25个细胞中的自噬体进行了计数。
图7
图7。线粒体在自噬体生物发生中的维持
（A）YFP-Mito公司立方厘米5TM独特标记自噬体；其他跨越整个膜的跨膜结构域的外膜线粒体蛋白无法标记自噬体。其他标记物的缺乏支持了YFP-Mito的独特传递机制立方厘米5TM标记由于其特殊的膜结合。（B）自噬体芽位置示意图。尖锐的膜曲率选择弯曲膜内外叶上的不同脂质。小叶的独特成分会阻碍蛋白质的扩散，并对特定的脂质环境产生偏好。（C）显示cb5跨膜结构域报告形式的示意图。野生型可以存在于仅与靶膜的外小叶相互作用的扭结螺旋中。P115A突变插入双层的两个小叶。（D）图像显示P115A cb5突变体和自噬体标记CFP-LC3缺乏共定位。（E）定量比较两种形式的外膜标记。将cb5中的脯氨酸115突变为丙氨酸™跨膜结构域取消了其向自噬体的传递。（D中的比例尺：10μm）。（F）自噬体生物发生过程中利用线粒体膜的一种拟议方法的示意图（在讨论中描述）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 并非所有的自噬膜都是平等产生的。
    McEwan DG，Dikic I。 McEwan DG等人。 单元格。2010年5月14日；141(4):564-6. doi:10.1016/j.cell.2010.04.030。 单元格。2010 PMID：20478247
  • 自噬：从一层膜到另一层膜。
    Wrighton KH公司。 Wrighton KH公司。 Nat Rev Mol细胞生物学。2010年7月；11(7):464. doi:10.1038/nrm2920。Epub 2010年6月9日。 Nat Rev Mol细胞生物学。2010 PMID：20531425 没有可用的摘要。

类似文章

  • 自噬体在ER-mitochondria接触部位形成。
    滨崎步M、古鲁塔N、松田A、内祖A、山本A、藤田N、青森H、野田T、原口T、平冈Y、天野A、吉森T。 Hamasaki M等人。 自然。2013年3月21日；495（7441）：389-93。doi:10.1038/nature11910。Epub 2013年3月3日。 自然。2013 PMID：23455425
  • 管状网络的形成保护线粒体在营养缺乏期间免受自噬体降解。
    Rambold AS、Kostelecky B、Elia N、Lippincott-Schwartz J。 Rambold AS等人。 美国国家科学院院刊2011年6月21日；108(25):10190-5. doi:10.1073/pnas.1107402108。Epub 2011年6月6日。 美国国家科学院院刊2011。 PMID：21646527 免费PMC文章。
  • HRES-1/Rab4促进LC3（+）自噬体的形成和自噬过程中线粒体的积累。
    Talaber G、Miklos损G、Oaks Z、Liu Y、Tooze SA、Chudakov DM、Banki K、Perl A。 Talaber G等人。 公共科学图书馆一号。2014年1月3日；9（1）：e84392。doi:10.1371/journal.pone.0084392。2014年电子收集。 公共科学图书馆一号。2014 PMID：24404161 免费PMC文章。
  • 自噬体生物发生机制。
    Rubinsztein DC、Shpilka T、Elazar Z。 Rubinsztein DC等人。 当前生物量。2012年1月10日；22（1）：R29-34。doi:10.1016/j.cub.2011.11.034。 当前生物量。2012 PMID：22240478 审查。
  • 线粒体：自噬体膜的起源之一？
    罗S、陈Q、Cebollero E、邢D。 Luo S等人。 线粒体。2009年7月；9(4):227-31. doi:10.1016/j.mito.2009.04.004。Epub 2009年5月3日。 线粒体。2009 PMID：19398041 审查。
查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Achleitner G、Gaigg B、Krasser A、Kainersdorfer E、Kohlwein SD、Perktold A、Zellnig G、Daum G。酵母内质网和线粒体之间的结合促进了磷脂通过膜接触的细胞器间运输。欧洲生物化学杂志。1999;264:545–53.-公共医学
    1. Axe EL、Walker SA、Manifava M、Chandra P、Roderick HL、Habermann A、Griffiths G、Ktistakis NT。富含磷脂酰肌醇3−磷酸并动态连接到内质网的膜室形成自噬体。细胞生物学杂志。2008;182:685–701.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bernales S、McDonald KL、Walter P.自噬在未展开蛋白反应期间抵消内质网扩张。《公共科学图书馆·生物》。2006;4:e423。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bjorkoy G、Lamark T、Brech A、Outzen H、Perander M、Overvatn A、Stenmark H、Johansen T.p62/SQSTM1形成通过自噬降解的蛋白质聚集体，对亨廷顿诱导的细胞死亡具有保护作用。细胞生物学杂志。2005;171:603–14.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Borgese N，Gazzoni I，Barberi M，Colombo S，Pedrazzini E.通过独立但竞争的途径将尾部锚定蛋白靶向内质网和线粒体外膜。分子生物学细胞。2001;12:2482–96.-项目管理咨询公司-公共医学

LinkOut-更多资源