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。2010年6月16日；29(12):2082-96.
doi:10.1038/emboj.2010.81。 Epub 2010年5月14日。

GCN2-ATF4通路对肿瘤细胞存活和增殖对营养缺乏的反应至关重要

叶江斌 1, 莫妮卡·库马诺娃, 洛里·哈特, 凯利·斯隆, 张海燕, 迭戈·N·德帕尼斯, 叶卡捷琳娜·波布罗夫尼科娃-马戎, J阿兰·迪尔, 大卫·罗恩, 君士坦丁诺·库梅尼斯
附属公司

GCN2-ATF4通路对肿瘤细胞存活和增殖对营养缺乏的反应至关重要

叶江斌等人。 浮雕J。 。

摘要

转录因子ATF4调节参与氨基酸代谢、氧化还原稳态和内质网应激反应的基因表达，在人类实体肿瘤中过度表达，表明其在肿瘤进展中具有重要作用。在这里，我们报告了ATF4表达的抑制阻止了转化细胞的增殖和存活，尽管最初激活了细胞保护性巨自噬。敲除ATF4可显著降低天冬酰胺合成酶（ASNS）的水平和ASNS的过度表达，或补充反式天冬酰胺，逆转ATF4敲除细胞的增殖阻滞并提高存活率。在实体肿瘤中发现的氨基酸和葡萄糖剥夺应激激活了上游真核细胞起始因子2alpha（eIF2alpha）激酶GCN2，以上调参与氨基酸合成和运输的ATF4靶基因。与正常组织相比，在人类和小鼠肿瘤中观察到GCN2激活/过度表达和磷酸化eIF2alpha增加，并且ATF4或GCN2表达的消除显著抑制体内肿瘤生长。我们得出结论，GCN2-eIF2alpha-ATF4通路对于维持肿瘤细胞的代谢稳态至关重要，使其成为抗肿瘤方法的一个新的和有吸引力的靶点。

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数字

图1
图1
敲除ATF4抑制肿瘤细胞存活和增殖。(A类)thapsigargin处理细胞（Tg，1μM，4 h）或DMSO处理细胞核部分的ATF4蛋白水平。Lamin A/C用作加载控制。(B类)电镀后48 h，通过MTT分析测定在NEAA（100μM）存在或不存在的情况下培养的HT1080和DLD1细胞的存活率（数据表示平均值±标准偏差。，n个=3,*P（P）<0.05). 细胞存活率归一化为对照组（shNT细胞无NEAA）。(C类)细胞增殖试验。HT1080细胞在含有/不含NEAA的DMEM中培养24小时（左面板）。细胞核（Hoechst，蓝色）和增殖细胞（EdU，红色）的荧光染色。（右面板）随机选择三张照片，并计算EdU阳性和总细胞核数。增殖指数百分比是通过增殖细胞核数除以细胞核总数来计算的。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05）。
图2
图2
敲除ATF4可诱导肿瘤细胞凋亡。(A类)HT1080 shNT和shATF4细胞在含有或不含NEAA的DMEM中生长24小时的相控图像。所示图像在×400倍放大下拍摄。(B类)HT1080 shNT和shATF4细胞中裂解PARP的免疫印迹。β-肌动蛋白作为负荷对照。HT1080细胞在含有/不含NEAA的DMEM中培养24小时(C类)Caspase3/7活性归一化为细胞总数。HT1080细胞在含有/不含NEAA的DMEM中培养24小时(D类)感染对照组（Av-Cre）或表达腺病毒的小鼠ATF4（Av-mATF4）的HT1080 shNT和shATF4细胞的相控图像显示为放大×400倍。感染后，细胞在不含NEAA的DMEM中培养。感染后24小时拍摄图像。(E类)使用MTT法测定感染细胞中的相对细胞存活率。感染24小时后，等量的细胞被接种在无NEAA的DMEM中。48小时后进行MTT分析。感染后24小时收集相同条件下感染的细胞进行ATF4免疫印迹（底部）。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05）。
图3
图3
敲除ATF4可诱导肿瘤细胞的保护性自噬。(A类)自噬标记物的免疫印迹从HT1080 shNT和shATF4细胞的全细胞裂解液中切割LC3，在DMEM中与NEAA孵育24小时。β-肌动蛋白用作负荷对照。(B类)电子显微镜成像。箭头指向含有双层膜的自噬体。HT1080细胞在含有/不含NEAA的DMEM中培养24小时(C类)顶部：用pCMV-GFP-LC3转染HT1080 shNT和shATF4细胞，并在DMEM中培养。48小时后，细胞在成像前用Hoechst染色。底部：细胞自噬（点状）形态定量。将自噬细胞百分数归一化为GFP信号细胞总数后计算。数据表示平均值（±s.e.m。，n个=3). (D类)用100 nM的非靶向siRNA（siNT）或靶向Atg7（siAtg7）的siRNA转染HT1080细胞。转染24小时后通过免疫印迹法分析Atg7、LC3和切割的PARP水平。α-管蛋白被用作负荷控制。(E类)用100 nM非靶向siRNA（siNT）或靶向ATG7（siATG7）的siRNA转染HT1080细胞。72小时后，通过MTT法测定HT1080和DLD1细胞的细胞存活率。实验一式三份。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05）。
图4
图4
补充Asn或ASNS过度表达可挽救shATF4细胞的存活。(A类)在DMEM中生长的HT1080（左）或DLD1（右）细胞的存活时间为48小时，DMEM中补充了100μM浓度的指定氨基酸(B类)HT1080 shNT/shATF4细胞的克隆存活率。左图：代表性实验图片。右：HT1080 shNT/shATF4细胞的克隆存活率。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=4,*P（P）<0.05.) (C类)使用实时RT-PCR测量HT1080 shNT/shATF4细胞中ASNS mRNA水平。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05.) (D类)转染HT1080细胞中ASNS的表达和细胞存活。（左面板）顶部带代表HA-标记的ASNS，下部带代表内源性ASNS。（右面板）HT1080 shNT和shATF4细胞在指定治疗后的存活率。24小时后，收集转染细胞进行免疫印迹或进行MTT试验（48小时）。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05）。
图5
图5
敲除ATF4增加了对谷氨酰胺缺乏的敏感性。(A类)ASNS催化的生物合成反应。(B类)在DMEM中生长的HT1080（左面板）或DLD1（右面板）细胞存活率（有/无4mM）L（左）-谷氨酰胺48h(C类)HT1080细胞在含有/不含Gln或Asn的DMEM中存活48小时。Gln:4 mM，Asn:100μM。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05）。
图6
图6
氨基酸剥夺下GCN2-eIF2α通路的激活促进细胞存活，上调ATF4和p21，并激活自噬。(A类)HT1080 shNT和shATF4细胞在指定的培养基中孵育24小时。收集全细胞裂解物，用指定的抗体进行免疫印迹（IB）或免疫沉淀（IP）。(B类)GCN2型+/+和GCN2−/−MEF与/不与4mM Gln孵育24 h，并进行免疫印迹。(C类)eIF2αwt或eIF2 a S51A突变MEF与/不与4 mM Gln孵育24 h，并用指示的抗体进行免疫印迹。p-eIF2a和ASNS印迹下方的数字表明，标准化为α-微管蛋白水平的折叠变化。使用NIH Image共享软件图像分析程序的Scion Image版本进行分析。(D类)GCN2型+/+和GCN2−/−MEF与Met或Gln孵育48小时。使用MTT分析细胞存活率。（数据表示平均值±s.e.m。，n个=3,*P（P）<0.05.) (E类)野生型，GCN2−/−和eIF2αS51A突变MEF在不含4 mM Gln的情况下培养1 h或3 h，细胞裂解物进行免疫印迹。(F类)稳定转染shNT或shGCN2质粒的HT1080细胞在不含Gln的情况下培养1或3 h，细胞裂解物用指示的抗体进行免疫印迹。
图7
图7
葡萄糖剥夺激活GCN2-eIF2α-ATF4通路。(A类)将HT1080细胞与25 mM葡萄糖孵育16 h。收集全细胞裂解物（WL）进行免疫印迹（IB）或免疫沉淀（IP）。(B类)将HT1080细胞在无葡萄糖的DMEM中培养16小时，添加指示浓度的谷氨酰胺，并对裂解产物进行免疫印迹。(C类)细胞被剥夺葡萄糖2和4小时，并通过LC-MS分析单个氨基酸的水平(D类)野生型，GCN2−/−和PERK−/−MEF在无葡萄糖DMEM中孵育8小时，收集细胞进行免疫印迹。谷氨酰胺剥夺治疗4小时(E类)将HT1080细胞与25 mM葡萄糖孵育8 h，提取总RNA用于ATF4靶点ASNS（左）或SLC1A4（右）的实时PCR。(F类)HT1080细胞在有/无25 mM葡萄糖的情况下培养，2×104细胞/孔。shATF4细胞补充1×NEAA。24小时后，用MTT法测定细胞存活率，并将存活率归一化为高糖组的存活率。
图8
图8
抑制GCN2-ATF4通路阻止肿瘤生长体内. (A类)左图：裸鼠HT1080 shNT/shATF4细胞的异种移植肿瘤，每侧注射2×106细胞。肿瘤生长了3周。右侧面板：实验结束时的平均肿瘤重量(N个=10,*P（P）<0.05，单尾学生t吨-测试）。(B类)左面板：肿瘤切片中Ki67（红色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）复染。肿瘤以200倍放大率拍摄。右侧面板：Ki67信号的量化。(C类)HT1080 shNT、shATF4和shATF4+ASNS肿瘤异种移植物的生长。Nu/Nu小鼠每侧注射2×106HT1080电池(N个=8). 注射后4天，每隔2–3天测量肿瘤体积。误差条代表s.e.值。*P（P）<0.05，学生双尾t吨-测试。(D类)K-RasV12-转化GCN2的生长+/+和GCN2−/−MEF公司体内Nu/Nu小鼠每侧注射2.5×106MEF公司。肿瘤生长了9天。实验结束时，切除肿瘤，拍照（左）并称重（右）。(N个=4,*P（P）<0.05，单尾学生t吨-测试）。(E类)HT1080 shNT和shGCN2肿瘤异种移植物的生长。Nu/Nu小鼠每侧注射2×106shNT公司(N个=7）或shGCN2电池(N个=10). 注射6天后，每隔2-3天测量肿瘤体积。
图9
图9
GCN2/p-eIF2α途径在人类和小鼠自发肿瘤中被激活。(A类)人类肿瘤组织（T）和相应正常组织（N）样本中GCN2和p-eIF2α的免疫印迹。Ku80被用作装载控制。(B类)乳腺癌病毒MMTV-Neu小鼠株正常（N）和肿瘤（T）样本中GCN2、p-eIF2α和ATF4的免疫印迹。使用β-肌动蛋白的免疫印迹作为负载对照。(C类)NIH TARP联合体中人类正常组织和肿瘤组织中p-GCN2和总GCN2的表达。仅使用二级抗体染色作为阴性对照。图像在40倍放大下拍摄。(D类)人结直肠癌肝转移连续切片中P-GCN2、P-eIF2α、总GCN2和总eIF2β的表达。p-eIF2α染色的特异性通过抗体孵育前用λ磷酸酶（λ-PPase）处理的样品中的信号降低来证明。
图10
图10
GCN2、ATF4、ASNS和Asn在保护肿瘤细胞免受微环境应激中的功能模型。蓝色箭头表示主要是对营养剥夺应激的反应信号，绿色箭头表示主要来自缺氧应激的信号。常见路径用黑色箭头表示。ATF4可能对缺氧具有此处未描述的其他功能。
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中的注释

  • 肿瘤是如何适应营养压力的？
    Wek RC，Staschke KA公司。 Wek RC等人。 EMBO J.2010年6月16日；29(12):1946-7. doi:10.1038/emboj.2010.110。 EMBO J.2010。 PMID：20551969 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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