Inhibition of phosphatidylcholine-specific phospholipase C downregulates HER2 overexpression on plasma membrane of breast cancer cells

doi:10.1186/bcr2575

.2010;12（3）：R27。

doi:10.186/bcr2575。 Epub 2010年5月12日。

抑制磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C下调乳腺癌细胞质膜HER2的过度表达

路易莎·巴黎¹, 塞雷娜·切切蒂, 弗朗西丝卡·斯帕达罗, 劳拉·阿巴尔萨莫, 卢安娜·卢吉尼, 玛丽亚·埃琳娜·皮萨努, 埃吉迪奥·伊奥里奥, 皮尔·乔治·纳塔利, 卡洛·拉莫尼, 弗朗卡·波多

附属公司

PMID： 20462431
预防性维修识别码：项目经理2917016
内政部： 10.1186/公元2575年

磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C的抑制下调乳腺癌细胞质膜HER2的过度表达

路易莎·巴黎等。乳腺癌研究. 2010.

.2010;12（3）：R27。

doi:10.1186/bcr2575。 Epub 2010年5月12日。

作者

路易莎·巴黎¹, 塞雷娜·切切蒂, 弗朗西丝卡·斯帕达罗, 劳拉·阿巴萨莫, 卢安娜·卢吉尼, 玛丽亚·埃琳娜·皮萨努, 埃吉迪奥·伊奥里奥, 皮尔·乔治·纳塔利, 卡洛·拉莫尼, 弗朗卡·波多

附属

¹意大利罗马Viale Regina Elena 299，Istituto Superiore di Saniá，细胞生物学和神经科学系，分子和细胞成像科。luisa.paris@iss.it

PMID： 20462431
预防性维修识别码：项目经理2917016
内政部： 10.1186/公元2575年

摘要

简介：据报道，25%至30%的乳腺癌患者的人表皮生长因子受体2（HER2）在质膜上过度表达。与表皮生长因子受体（EGFR）家族同源成员形成异二聚体，如HER3和EGFR，激活负责肿瘤发生和进一步转录HER2基因上调的异常细胞吞噬级联。靶向控制HER2过度表达和再循环的分子机制可以有效地使反馈放大回路失活。我们最近发现，磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）失活可能在选择性调节与细胞功能相关的特定受体或蛋白在膜上的表达中发挥关键作用。在本研究中，我们研究了PC-PLC抑制的能力，通过改变HER2的内吞和溶酶体降解速率，以靶向控制HER2在乳腺癌细胞膜上过度表达的分子机制。

方法：通过共聚焦激光扫描显微镜、流式细胞术、细胞表面生物素化、脂筏分离和免疫沉淀实验，研究了HER2过度表达和HER2低表达乳腺癌细胞株的细胞膜定位以及PC-PLC与HER2、EGFR和HER3的相互作用。PC-PLC抑制剂三环癸烷-9-基-黄原酸钾（D609）对膜上HER2表达的影响，以及在HER2过度表达的SKBr3细胞中HER2、HER2-HER3和HER2-EGFR总含量的影响，在短暂或连续受体与抗HER2单克隆抗体接触后进行监测，包括曲妥珠单抗。在持续暴露于D609或与曲妥珠单抗联合作用的SKBr3、BT-474和MDA-MB-453细胞中，检测HER2表达和细胞增殖的变化。

结果：PC-PLC选择性地聚集在HER2过度表达细胞的质膜上，在筏结构域中与HER2共定位并结合。PC-PLC抑制导致HER2内化和溶酶体降解增强，导致膜上HER2表达下调。此外，PC-PLC抑制导致HER2在细胞膜上的再表达受到强烈抑制，HER2、HER2-HER3和HER2-EGFR异二聚体的总细胞含量降低。PC-PLC抑制剂也可诱导抗增殖作用，尤其是在曲妥珠单抗耐药细胞中。

结论：结果表明，PC-PLC抑制作为一种潜在的手段，可以抵消HER2扩增的致瘤效应，并补充当前HER2靶向治疗的有效性。

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数字

图1
**PC-PLC在乳腺癌细胞质膜上的表达**.（a）PC-PLC检测用六个未固定细胞系的CLSM分析（假彩色灰色）。上部面板显示了单个细胞的三维重建示例（比例尺，5μm）；下部面板显示一组细胞的单个中央部分（标尺，20μm）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。**（b、c）**未固定细胞的FACS分析：所示细胞系PC-PLC相对荧光强度的代表性细胞荧光直方图**（b）**PC-PLC阳性细胞的百分比（平均值±SD）**（c）**HER2过度表达（SKBr3和MDA-MB-453）和HER2非过度表达（MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435）癌细胞系之间的差异具有统计学意义*P（P）*< 0.001. 在每个细胞系上进行了五个独立的实验。

图2
**PC-PLC和HER2在SKBr3细胞质膜上的定殖**.（a）利用兔多克隆α-PC-PLC（绿色）和α-HER2 W6/100 mAb（红色）对未固定（顶部和中间面板）或固定和渗透SKBr3细胞（底部面板）中的PC-PLC和HER2进行CLSM检测。彩色化区域用黄色表示。中间的面板显示了PC-PLC和HER2在质膜上表达的三维重建。比例尺，8μm。针对每种情况，至少进行了五个独立的系列实验。**（b）**用链霉亲和素HRP（左，IB:STREP HRP）或α-PC-PLC（右，IB:α-PC-PLC）检测从SKBr3细胞分离的免疫沉淀生物素化蛋白的PC-PLC免疫印迹分析。TL，总裂解物；bTL，生物素化总裂解物；CTR IgG，α-PC-PLC IgG的对照；IPα-PC-PLC，α-PC-PLC免疫沉淀物*IgG重链。**（c）**从SKBr3细胞裂解物中分离出的蔗糖梯度组分，并通过Western blotting分析HER2（185 kDa）和PC-PLC（66 kDa）检测。T、总细胞裂解物。**（d，e）**α-HER2和α-PC-PLC的Western blot分析**（d）**和α-EGFR和α-PC-PLC（e）免疫沉淀物（IP），用相互的Abs（分别为α-PC-PLC、α-HER2和α-EGFR）进行印迹，并与相应的对照组（CTR-IgGα-PC-PLC、CTR-Ig Gα-HER2、CTR-IgG a-EGFR）进行比较。面板**b、 c、d**，显示了三个独立实验的代表性结果。面板中的免疫沉淀**e（电子）**重复了两次。

图3
**D609诱导SKBr3细胞PC-PLC抑制和HER2下调**.（a）Amplex红色^®暴露于PC-PLC抑制剂D609后检测SKBr3细胞。在D609（50μg/mL，黑色柱）存在下测量相对PC-PLC活性，并与未经处理的对照细胞进行比较(t吨=0取1.0或t吨=72小时，白色列）。直方图表示平均值±SD（n=4）。**（b）**完整培养基中未固定SKBr3细胞的CLSM分析(t吨=0），并且在D609存在的情况下，在指定的时间段内。洗涤后，用α-PC-PLC（绿色）和α-HER2（红色）对细胞进行染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。彩色化区域用黄色表示。比例尺，5μm。这些实验独立重复3次。

图4
**PC-PLC抑制对SKBr3细胞HER2内化的影响**在完全培养基中培养的SKBr3细胞的CLSM分析(t吨=0）或D609（50μg/mL）在指定的培养时间内。清洗后，细胞固定并用α-PC-PLC（绿色）和α-HER2 Abs（红色）染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。彩色化区域以黄色（绿色和红色的融合）或青色（绿色和DAPI的融合）表示。比例尺，8μm。面板显示了五个独立系列实验的代表性例子。

图5
**D609对SKBr3细胞HER2受体分子转运和降解的影响**.（a）SKBr3细胞的CLSM分析，用PC-PLC抑制剂D609（50μg/mL）培养指定的时间间隔，然后固定并用α-HER2 mAb W6/100（红色）和α-Rab5B Ab（绿色）染色一通过d日)或α-灯2 Ab（绿色，面板**e（电子）**通过小时). 细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，8μm。**（b）**未经处理或与D609孵育6和24小时的SKBr3细胞总裂解物的Western blot分析。用α-HER2或α-PC-PLC抗体培养印迹。肌动蛋白作为定量负荷控制。面板中显示的实验一和b条分别独立重复3次和4次。

图6
**短期受体与抗HER2抗体结合后D609诱导SKBr3细胞质膜HER2再表达的阻滞**.（a）用α-HER2 mAb 300G9瞬时结合（4°C下30分钟）未固定细胞进行CLSM检查，然后用山羊α-小鼠Alexa Fluor-594（对照组一，红色），然后在37°C下在完全无抗体培养基中培养指定的时间段(b条通过克)或存在D609，50μg/mL(小时通过**o（o）**). 在每个时间间隔结束时，细胞再次用α-HER2 W6/100 mAb在质膜上染色，然后用山羊α-小鼠Alexa Fluor-488（绿色）染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，8μm。这些分析独立进行了3次。**（b）**SKBr3细胞的Western blot分析首先与α-HER2 300G9 mAb结合，然后与山羊α-小鼠抗体结合，然后在37°C下，在没有或存在D609的情况下培养指定的时间段。用α-HER2或抗β肌动蛋白抗体孵育印迹。这些实验在七组独立的细胞制剂上重复进行。

图7
**D609对持续暴露于曲妥珠单抗的SKBr3细胞HER2表达的影响**.（a）在D609存在或不存在的情况下，对暴露于曲妥珠单抗指定时间间隔后固定的细胞进行CLSM分析。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，20μm。**（b）**用D609（50μg/mL）、曲妥珠单抗（HERC，10μg/mL。CTR，未经处理的对照细胞。CLSM和免疫印迹分析重复3次。

图8
**PC-PLC抑制对EGFR和HER3内化、总受体含量和HER2异二聚体形成的影响**.（a）固定SKBr3细胞暴露于D609后不同时间间隔的CLSM分析，并用α-HER3（上面板）或α-EGFR抗体染色（下面板）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，20μm。**（b）**SKBr3细胞的免疫印迹（IB）和免疫沉淀（IP）实验，与D609孵育24小时，以检测HER3和EGFR的总含量（左面板）及其与HER2的异二聚体水平（右面板）。中央面板显示了α-HER3和α-EGFR抗体在免疫沉淀各自靶受体方面的效率。ET CTR，对照细胞总提取物；ET D609，D609处理细胞的总提取物；CTR-IgG，控制α-HER3或α-EGFR抗体的IgG；IP-CTR，对照细胞免疫沉淀；IP D609，来自D609处理细胞的免疫沉淀。给出了两个独立实验的代表性示例。

图9
**PC-PLC抑制对HER2过度表达细胞的抗增殖作用**.MTT分析**（a）**SKBr3和**（b）**BT-474细胞均暴露于曲妥珠单抗（HERC，10μg/mL），或**（c）**在与D609、曲妥珠单抗（HERC）或其组合（COMB）孵育指定时间后，MDA-MB-453暴露于曲妥珠单抗（50μg/mL）。通过定义未处理细胞的吸收率为100%来计算细胞增殖百分比。直方图表示独立系列分析的平均百分比（SKBr3和BT-474的±SD（n=3）；或MDA-MB-453的±最大偏差（n=2））。差异的重要性：***P（P）*≤ 0.02; ****P（P）*< 0.005.

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