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.2010年6月；7(6):461-5.
doi:10.1038/nmeth.1459。 Epub 2010年5月9日。

单分子实时测序期间直接检测DNA甲基化

本杰明·弗鲁斯伯格 1, 戴尔·R·韦伯斯特, 杰西卡·H·李, 凯文·特拉弗斯, 埃里克·奥利瓦雷斯, 泰森·A·克拉克, 乔纳斯·科拉赫, 史蒂芬·W·特纳
附属公司

单分子实时测序期间直接检测DNA甲基化

本杰明·弗罗斯伯格等。 Nat方法. 2010年6月.

摘要

我们描述了通过单分子实时（SMRT）测序直接检测DNA甲基化，无需亚硫酸氢转化。在SMRT测序中，DNA聚合酶催化荧光标记核苷酸并入互补核酸链。产生的荧光脉冲的到达时间和持续时间产生聚合酶动力学信息，并允许直接检测DNA模板中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。聚合酶动力学的测量是SMRT测序的固有部分，不会对初级DNA序列的测定产生不利影响。不同的修饰对聚合酶动力学的影响不同，从而可以区分它们。我们使用这些动力学特征来鉴定基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现，结合环形共识测序，它们可以实现以碱基对分辨率的表观遗传修饰的单分子鉴定。这种方法适用于长读取长度，并可能在甚至高度重复的基因组区域中绘制甲基化模式。

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数字

图1
图1
SMRT测序期间检测DNA甲基化的原理和相应示例。(一)含有甲基化（顶部）或非甲基化（底部）腺苷的DNA链聚合酶合成示意图。(b条)来自这些模板的典型SMRT测序荧光痕迹。荧光示踪脉冲上方的字母表示包含在生长互补链中的核苷酸的身份。虚线箭头表示合并同源T之前的IPD，对于这个典型示例，模板中mA的IPD比A大约5倍。
图2
图2
SMRT序列介导的甲基化DNA碱基检测。所有三个面板都显示了甲基化模板中的平均IPD与对照模板中的平均IPD的比率，相对于DNA模板位置绘制。在显示的区域中，除了三角形标记的两个位置外，这两个模板是相同的。聚合酶合成朝着增加位置数的方向进行。虽然在所有情况下，这两个模板都具有圆形拓扑结构，长度为199个碱基，但为了清晰起见，仅显示了甲基化区域周围的90个碱基段。误差条表示每个模板位置的s.e.m.IPD比率（平均值n个=（a）中每个位置的346个测量值，平均值n个=（b）中每个位置的504，平均值n个=（c）中每个位置393，使用自举技术（在线方法）计算。
图3
图3
C、mC和hmC IPD和PW特征的主成分分析。每个主成分是位置71-79处平均IPD和PW的线性组合，围绕可变修改模板位置73。各位置IPD和PW的权重如补充表1所示。通过将IPD和PW值的随机20%子样本投影到前两个主成分（PC1和PC2）上，然后转换为z评分（在线方法），计算出图上的数据点。
图4
图4
合成DNA模板中A和mA的IPD分布。(一)总长度为199个碱基的DNA模板示意图。(b条)两个模板指定位置的IPD分布。对于每一行，直方图描述了平均IPD的分布（在指定的循环子读取数上取平均值）。(c（c）)基于（b）中差异甲基化位置的IPD分布并通过IPD阈值参数化的受体操作特征（ROC）曲线，用于在一个（灰色）、三个（红色）或五个（蓝色）圆形共识测序子读取后将甲基化状态分配给腺苷核苷酸。黑色虚线描绘了随机猜测甲基化状态的ROC曲线。请注意，因为模板的长度为199个基数，所以五个完整的循环子读取对应于近1000个基数的读取长度。
图5
图5
DNA样品SMRT测序动力学的比较水坝+大肠杆菌以及对于全基因组扩增（WGA）后的相同样品。该样本包含一个3.7-kb的子区域秀丽线虫将磷克隆到大肠杆菌矢量。(一)样品50-bp窗口GC含量，绘制与模板位置的关系图。(b条)每个模板位置的平均IPD水坝+样品。(c（c）)WGA样本中每个模板位置的平均IPD。(d日)平均住院日比率(水坝+（b）除以（c）中的WGA，绘制与模板位置的关系图。具有GATC上下文的位置，其中预期序列基序GATC处腺嘌呤甲基化，用黑色方块表示，所有其他位置用蓝色开圆圈表示。GATC位置的误差线表示这些位置的s.e.m.IPD比率（平均值n个=每个位置的106个测量值）。为了进行比较，非GATC位置（蓝色圆圈）的所有IPD比率的平均值±s.d.为1.00±0.24(n个为～389000个测量值）。该fosmid地区的平均测序覆盖率是水坝+样品和91倍的WGA样品。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 以DNA甲基体为中心，无BS。
    Ecker JR公司。 Ecker JR公司。 自然方法。2010年6月；7(6):435-7. doi:10.1038/nmeth0610-435。 自然方法。2010 PMID：20508637 没有可用的摘要。
  • 技术：测序时DNA甲基化。
    穆尔斯M。 穆尔斯M。 Nat Rev基因。2010年7月；11(7):454. doi:10.1038/nrg2817。 Nat Rev基因。2010 PMID：20517344 没有可用的摘要。

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