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.2010年7月9日；285(28):21329-40.
doi:10.1074/jbc。M109.095299。 Epub 2010年5月6日。

内质网应激反应因子CHOP-10保护低氧诱导的神经元死亡

马克·沃尔特曼 1, 莫莉·吉尔, 克里斯·德耶稣, 小原光森, 尼娜·F·绍尔, 霍华德·费德罗夫
附属机构

内质网应激反应因子CHOP-10对缺氧诱导的神经元死亡具有保护作用

马克·沃尔特曼等人。 生物化学杂志. .

摘要

低氧诱导的基因表达是中风后神经元存活的关键决定因素。了解控制适应性和病理性转录的细胞自主遗传程序可能具有重要的治疗意义。为了确定低氧损伤后延迟神经元凋亡的调节因素，我们开发了一个体外培养模型，该模型重述了这些不同的反应，并使用微阵列表征了基因表达变化的序列。低氧诱导了数量不成比例的bZIP转录因子和内质网应激反应相关靶点。虽然ATF4表达的时间和空间方面与神经元丢失相关，但我们的结果不支持延迟CHOP表达的预期病理作用。相反，CHOP缺失增强了神经元对缺氧和thapsigargin介导的损伤的敏感性，并减弱了脑源性神经营养因子诱导的神经保护作用。此外，在缺氧开始之前强制表达CHOP可以保护野生型培养物免受随后的损伤。总之，这些发现表明CHOP在神经元对缺氧应激的反应中发挥着更复杂的作用，参与了缺血预处理和延迟的神经保护。

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数字

图1。
图1。
缺氧神经元培养中适应性和凋亡基因表达的时间分析。 A类，延迟交付暴露模式示意图。确定刺激核固缩所需的病理转录和翻译的时间窗在体外，游离的皮层培养物保持在任一常压下(开放式酒吧)或缺氧条件(实心钢筋，0.5%O2)，用载体（DMSO）、转录抑制剂放线菌素D处理(行动D)或翻译抑制剂环己酰亚胺(瑞士法郎)在缺氧开始后的不同时间点。B类和C类延迟添加放线菌素D（DMSO中1μg/ml）或CHX（200 n米)提高神经元细胞存活率在体外.培养24小时后评估核固缩水平；数据表示为比重核的绝对分数，显著性由Student’s测量吨测试（平均值±S.D.；*，第页<0.05；**，第页< 0.01; 和***，第页< 0.005).
图2。
图2。
低氧皮质神经元培养中基因表达的验证。 A类定量PCR验证低氧诱导的微阵列靶点。从常氧对照组（0小时）或暴露于3至18小时缺氧（0.5%O）的样品中制备的RNA2)对目标进行qPCR血管内皮生长因子,葡萄糖转运蛋白-1,香港国际投资银行,废气再循环-1,自动变速箱5、和第10章使用ΔΔC类T型通过Student t检验（*，第页<0.05；**，第页< 0.01; 和***，第页< 0.005; 缺氧与成对正常毒性对照）。B类缺氧激活持续缺氧（0.5%O2). 在指定的时间通过Western blotting分析样品的以下靶点：磷酸化和总eIF2α（p-eIF2）、ATF4、CHOP-10、裂解PARP（cPARP）、裂解caspase-3（cCasp3）和肌动蛋白。
图3。
图3。
ATF4和CHOP表达的免疫细胞化学分析。 A类，低氧诱导的ATF4表达与神经元培养物中的核浓缩共存（0.5%2，24小时，左侧面板). ATF4靶基因Tribbles 3的表达(三号机房)在暴露培养物中与核ATF4共定位(右上角). 低氧培养中ATF4和TRB3的表达呈时间依赖性增加。数据表示为表达ATF4或TRB3的细胞分数（12–24小时，0.5%O2)与未经处理的对照组相比，每个盖玻片平均有150个细胞(n个= 3).B类thapsigargin中CHOP的广泛表达模式(Tg（千克）)-经过处理的皮层培养物。用1μg/ml Tg处理正常毒性培养物24 h，并使用B-3单克隆CHOP抗体进行免疫细胞化学分析。C类CHOP-10在培养的胚胎神经元中广泛表达。使用CHOP反应性多克隆抗体F-168和单克隆抗神经元标记物NeuN进行双重免疫细胞化学分析。使用CHOP敲除培养物的结果显示F-168抗血清仅显示微弱的核周染色(比例尺= 20 μ米).
图4。
图4。
CHOP缺失对神经元存活的影响。 A类，通过Western blotting检测野生型但不敲除的CHOP-10蛋白(击倒对手)Tg暴露后培养物（1μg/ml，24小时；显示DMSO载体对照）。B类、野生型固缩反应(重量)和KO培养物暴露于DMSO（−）或Tg（1μg/ml）。C类二甲基亚砜对WT和KO培养物的存活分析(露天酒吧)或两次Tg剂量（10–100 ng/ml；n个=每种情况6）。D类低氧刺激诱导WT和KO培养物核固缩的情况（0.3%与0.1%氧2，24小时）。结果表示平均±S.D.显著性检验，通过方差分析和Newman-Keuls多重比较检验对事后分析进行显著性检验（*，第页<0.05；**，第页< 0.01; 和***，第页< 0.001).E类Western分析WT和KO培养物中裂解caspase-3（cCasp3）的水平。
图5。
图5。
shRNA-介导的CHOP-10敲低对神经元存活的影响。 A类pPRIME-CHOP慢病毒转移载体与表达载体eGFP-CHOP-V1一起转染N2A细胞，并在收集裂解物之前培养72 h。通过Western blotting测定表达的融合蛋白水平和内源性CHOP水平，并与荧光素酶靶向控制载体pPRIME-FF3比较基因沉默效率。B类荧光分析GFP表达和用表达GFP的pPRIME载体转导的培养物中的核固缩。C类用pPRIME-FF3或pPRIME-CH-B1慢病毒（感染倍数0.25）转导原代培养物（DIV4），暴露于缺氧2天后（24 h，0.3%O）2，24 h），并分析存活GFP阳性细胞的数量。D类，用pPRIME-FF3或pPRIME-CH-B1慢病毒转导原代培养物（DIV4）（感染多重性0.75），并暴露于缺氧（DIV6，24小时，0.3%O2)核固缩分析（DIV9）之前。结果显示为核固缩的平均±S.D.水平。通过Newman-Keuls多重比较检验的方差分析进行显著性检验，以进行事后分析（*，第页< 0.05).
图6。
图6。
增强CHOP-10表达可保护神经元免受缺氧。 A类，Western blotting证实编码全长的扩增子载体(重量)和缺少亮氨酸拉链的截短型CHOP(LZ公司-）在HEK293细胞中转染后表达。B类在低氧激发前12 h，用表达全长CHOP、LZ−突变或荧光素酶的扩增子病毒（感染倍数0.7）转导DIV6皮层神经元培养物作为对照。在非转导（无病毒）或病毒转导培养物暴露于对照组和缺氧条件下（24小时，0.5%氧自由基）评估核固缩水平2). 结果显示为核固缩的平均±S.D.水平（*，第页<0.05；**，第页<0.01）减去自发性核固缩的背景水平。
图7。
图7。
BDNF介导的保护需要CHOP。 A类，BDNF（50 ng/ml）预处理（12 h，n个=3）保护皮层神经元免受缺氧损伤（0.5%O2，24小时）。B类、对照组和BDNF处理的（50 ng/ml）野生型初级皮质培养物低氧激发前后的Western分析（0.3%O2，24小时）。C类上述BDNF处理野生型和CHOP敲除培养物，并在常温培养后进行Hoechst分析(N个和N个+B类)或缺氧(小时和小时+B类)条件。存活率数据来源于每份盖玻片平均250次计数(n个= 3; 平均值±S.D.）。D类，分析来自C类检测PARP和肌动蛋白的裂解水平。接触二甲基亚砜的对照样品(控制)或thapsigargin(Tg（千克）100纳克/毫升）。通过Newman-Keuls多重比较检验的方差分析进行显著性检验，以进行事后分析（*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001).
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