Smooth and cardiac muscle-selective knock-out of Kruppel-like factor 4 causes postnatal death and growth retardation

doi:10.1074/jbc.M110.112482

.2010年7月2日；285(27):21175-84.

doi:10.1074/jbc。M110.112482。 Epub 2010年5月3日。

平滑且心肌选择性地敲除Kruppel-like因子4会导致产后死亡和生长迟缓

Tadashi吉田¹, 琼干, 亚伦·S·弗兰克, 何若雅（Ruoya Ho）, 张继峰, Y尤金·陈, 松彦林, 马克·马杰斯基, 艾薇儿V索姆利奥, 加里·欧文斯

附属公司

PMID： 20439457
预防性维修识别码：下午2988332
内政部： 10.1074/jbc。M10.112482号

平滑且心肌选择性地敲除Kruppel-like因子4会导致产后死亡和生长迟缓

Tadashi吉田等。生物化学杂志. 2010.

.2010年7月2日；285(27):21175-84.

doi:10.1074/jbc。M110.112482。 Epub 2010年5月3日。

作者

Tadashi吉田¹, 琼干, 亚伦·S·弗兰克, 何若雅（Ruoya Ho）, 张继峰, Y尤金·陈, 松彦林, 马克·马杰斯基, 艾薇儿V索姆利奥, 加里·欧文斯

附属

¹弗吉尼亚大学分子生理学和生物物理系，弗吉尼亚州夏洛茨维尔，弗吉尼亚州22908，美国。tayoshida-npr@umin.ac.jp

PMID： 20439457
预防性维修识别码：项目经理2898332
内政部： 10.1074/jbc。M10.112482号

摘要

Krüppel样因子4（Klf4）是一种参与多种组织分化和增殖的转录因子。我们之前证明，三苯氧胺诱导小鼠Klf4基因的缺失加速了新生内膜的形成，但延迟了损伤后颈动脉平滑肌细胞分化标记物的下调。为了进一步确定Klf4在心血管系统中的作用，我们在此使用SM22alpha启动子（SM22alfa-CreKI（+）/Klf4（loxP/loxP）小鼠）衍生出平滑肌和心肌中Klf4基因缺陷的小鼠。SM22alpha-CreKI（+）/Klf4（loxP/loxP）小鼠以预期的孟德尔比率出生，但出生后逐渐死亡。尽管约40%的SM22alpha-CreKI（+）/Klf4（loxP/loxP）小鼠在出生后第28天存活，但它们表现出明显的生长迟缓。在野生型小鼠中，从胚胎发育晚期到成年，Klf4在心脏中表达，而在平滑肌中不表达。SM22alpha-CreKI（+）/Klf4（loxP/loxP）小鼠血管平滑肌细胞分化标记物的形态或表达没有变化。有趣的是，通过磁共振成像测定，SM22alpha-CreKI（+）/Klf4（loxP/loxP）小鼠的心输出量显著降低。此外，心脏中Klf4的缺乏导致包括Gata4在内的多个心脏基因的表达减少。心脏体内染色质免疫沉淀分析显示Klf4与Gata4基因的启动子区结合。结果提供了新的证据，证明Klf4在胎儿晚期和/或出生后心脏发育中起关键作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**平滑肌和心肌特异性缺失*Klf4公司*该基因与显著的产后死亡和生长迟缓相关。** A类，平滑和心肌特异性缺失的示意图*Klf4公司*基因显示。这个数字所示代表*Klf4公司*外显子。*三角形*代表*液氧磷*地点。*X（X）*，繁殖。B类，191个后代的基因型*SM22型*α-*CreKI公司*⁺(*CreKI公司*)/*Klf4公司^{液氧磷/重量}*小鼠和*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4型^{液氧磷/液氧磷}*小鼠出生时进行PCR检测。C类，Kaplan-Meier生存曲线*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*，*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{氧磷/重量}*，*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*、和*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/重量}*展示了老鼠(n个=每种基因型36个）。对趋势进行了对数秩检验。*，第页< 0.05.D类和E类，代表性图片*第22页*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*P1时的小鼠(D类)和第28页(E类)如图所示。F类，体重的变化*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*，*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/重量}*，*第22页*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*、和*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/重量}*显示出生后的小鼠(n个=每种基因型20～25）。*，第页与其他基因型相比<0.05。Docta代表平均值±S.E。

**图2。**
**Klf4在胚胎发育晚期到成年期的心脏中表达。** *A–F*，Klf4的表达通过免疫组织化学方法在E9.5的野生型胚胎中测定(A类)，E11.5处(B类)，E15.5处(C类)和E18.5处(D类)以及P1野生型新生儿的心脏(E类)和成人(F类)。DAB显示Klf4的表达，切片用苏木精复染。酒吧对于*A–C*，100微米；*D–F*，50微米。*H（H）*，心脏；*陆军部*，背主动脉；三第三鳃弓动脉；四、第四鳃弓动脉；*不及物动词*第六鳃弓动脉。*G公司*用双重免疫荧光染色法检测Klf4和Gata4在野生型小鼠心脏中的共定位。Alexa Fluor 555观察Klf4染色(红色)Alexa Fluor 488显示Gata4染色(绿色)。切片用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚复染(蓝色).箭头表示Klf4和Gata4共存的细胞。酒吧，50微米。*H–K*，检测主动脉中Klf4的表达(*H（H）*)骨骼肌(我)，胃(J型)和膀胱(*K（K）*)野生型小鼠。箭头表明主动脉内皮细胞(*H（H）*)和胃上皮细胞(J型)，表示Klf4。*性虐待*，平滑肌层。酒吧对于H和I，50μm；酒吧对于J和K，100μm。显示了具有代表性的图片。

**图3。**
**SM22α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^loxP/loxP*小鼠心脏中出现选择性Klf4表达缺失。** A类，删除*Klf4公司^液氧磷*在包括心脏、结肠和大脑在内的多个组织中检测等位基因*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*PCR测定P28小鼠(n个=每个基因型3个）。B类，的表达式*Klf4公司*通过实时RT-PCR检测心脏、骨骼肌中的mRNA(*sk.m（平方米）*)和大脑*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*第22页*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*第28页的小鼠(n个=每个基因型6个）。C类用免疫组织化学方法检测Klf4在皮肤、结肠和心脏的表达*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*第28页的小鼠。DAB显示Klf4，皮肤用天青B或结肠和心脏用苏木精复染切片。显示了具有代表性的图片(n个=每个基因型4个）。酒吧，100μm用于*上部面板*; 50μm用于*下部面板*.

**图4。**
**SM22α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^loxP/loxP*与对照组小鼠相比，小鼠SMC分化标记基因的表达或动脉结构没有差异。** A类和B类，胸主动脉来自*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*在生理压力下用10%福尔马林灌流P28小鼠，并将其包埋在石蜡中。交叉部分用Russell-Movat五色法染色(n个=每个基因型6个）。A类，显示了具有代表性的图片。酒吧，100微米。B类，使用ImagePro软件测量内侧区域（每只小鼠三个截面的平均值）。C类SMC分化标记基因的表达包括*学报2*和*我的11*通过实时RT-PCR在*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*，*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/重量}*、和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^loxP/loxP*P14的小鼠(n个=每个基因型5个）。D类，冠状动脉来自*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*用Russell-Movat五色法对P28小鼠进行切片和染色(n个=每个基因型6个）。显示了左前降动脉的代表性图片。酒吧，50微米。E类图中显示了E18.5胚胎冠状动脉的血管铸型。酒吧，1毫米。

**图5。**
**心脏的增殖和凋亡率没有改变*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*老鼠。** A类，来自*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*对P28小鼠进行切片，并用Russell-Movat五色法进行染色。显示了具有代表性的图片(n个=每个基因型6个）。酒吧，1毫米。B类和C类，测量心脏重量和心脏与体重的比值*第22页*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*P14和P28.*的小鼠，第页与相比<0.05SM22型α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*老鼠。D类和E类，Ki-67染色(D类)和TUNEL染色(E类)是在*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4型^{液氧磷/液氧磷}*第28页的小鼠(n个=每个基因型5个）。DAB显示Ki-67染色，切片用苏木精复染。异硫氰酸荧光素显示TUNEL染色，切片用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚复染。箭头表示染色细胞。酒吧，50微米。

**图6。**
**心脏中的多个心脏基因减少*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*老鼠。** A类和B类，在心脏进行微阵列分析*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*P14的小鼠(n个=每个基因型4个）。A类Klf4缺失导致的基因数量失调表现为折叠变化。B类用PANTHER对Klf4缺失后增加或减少>3倍的427个基因进行基因本体分析。显著丰富的生物过程(第页<0.03）。绘图是日志(第页值），阈值设置为1.5[-log（0.03）]。C类，多种心脏基因的表达，包括*Nppa公司*，*无购买力平价*，*行动1*，*我的7*，*塞尔卡2*、和*Gata4公司*通过实时RT-PCR检测心脏*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*，*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/重量}*、和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^loxP/loxP*P14的小鼠(n个=每个基因型5个）。D类、Klf4蛋白表达、心肌肌球蛋白轻链(*cMLC公司*)、Gata4和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(*GAPDH公司*)在心脏接受检查*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4型^{液氧磷/液氧磷}*通过Western blotting检测P14小鼠。显示了具有代表性的图片(n个=每个基因型3个）。

**图7。**
**Klf4通过结合*Gata4型*启动子区。** A类，的示意图*Gata4公司*所示为启动子。共识的Klf4结合位点5′-（G/A）（G/AGata4公司启动子，包含4个富含GC的元素和一个E盒。数字表示bp。B类，Klf4与*Gata4公司*基因与c-福斯基因由体内心脏ChIP测定*SM22型*α-*CreKI公司*^负极/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*和*SM22型*α-*CreKI公司*⁺/*Klf4公司^{液氧磷/液氧磷}*P14的小鼠(n个= 3). *,第页与对照组小鼠相比<0.05。抗体，抗体。

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