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.2010年5月；16（5）：535-43，1p接143。
doi:10.1038/nm.2144。 Epub 2010年5月2日。

G2/M上皮细胞周期阻滞介导损伤后肾纤维化

李阳 1, 塔蒂亚娜·贝谢特诺娃, 克雷格·布鲁克斯, 贾格什五世沙阿, 约瑟夫·波温特
附属公司

G2/M上皮细胞周期阻滞介导损伤后肾纤维化

李阳等。 自然·医学. 2010年5月.

摘要

纤维化是导致慢性进行性肾衰竭的原因，在发达国家，这种疾病存在于大量成年人中。人们越来越认识到，导致异常不完全修复的急性肾损伤（AKI）是慢性纤维化肾病的主要病因。损伤后触发纤维生成反应的机制尚不清楚。在AKI的缺血、毒性和梗阻模型中，我们证明上皮细胞周期G2/M阻滞与纤维化结局之间存在因果关系。G2/M阻滞的近端肾小管细胞激活c-jun NH（2）-末端激酶（JNK）信号，其作用是上调纤维化前细胞因子的产生。用JNK抑制剂治疗，或通过服用p53抑制剂或切除对侧肾脏绕过G2/M期阻滞，可挽救单侧缺血性损伤肾脏的纤维化。因此，G2/M期上皮细胞周期阻滞及其随后的下游信号传导是迄今为止尚未认识到的预防纤维化和阻断肾脏疾病加速进展的治疗靶点。

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图1
图1
AKI模型的临床病理特征。(一)AKI小鼠模型，包括中度和重度IRI和AAN（左）以及单侧IRI（UIRI）和UUO（右）模型中血清肌酐随时间的变化(n个=每个时间点8）*P（P）< 0.001,#P（P）与手术前第0天相比，<0.01。(b条)AKI模型纤维化结局的组织学研究(n个每组3只小鼠，Masson三色染色显示纤维化（蓝色）。(c（c）)Sircol法测定五种AKI模型中肾脏胶原含量(n个=每组3只小鼠）*P（P）<0.001与对照，#P（P）<0.001与中度IRI(d日)AKI模型中IV型胶原（左，绿色（抗IV型胶原））和α-SMA（右，红色（抗α-SMA））的免疫染色(n个=每组3只小鼠）。(e（电子）)42天（中度IRI、重度IRI、UIRI和AAN）或14天（UUO）肾脏中IV型胶原、I型胶原和α-SMA阳性染色的总组织面积百分比*P（P）<0.001与对照，#P（P）与中度IRI相比，<0.001。比例尺，50μm。误差线代表s.d。
图2
图2
AKI模型中肾小管细胞的修复。(一)中度IRI、UIRI和AAN小鼠Ki-67阳性（左）、BrdU阳性（中）或p-H3阳性（右）肾小管细胞的数量（每400×场）(n个=每组每个时间点3只小鼠）*P（P）<0.01与假手术，#P（P）与对照组相比<0.01。(b条)中度IRI（左）、UIRI（中）和AAN（右）模型中肾小管细胞的细胞周期分布（G1、S和G2/M）与损伤后时间的关系(n个=每组每个时间点3只小鼠）。(c（c）)中度IRI、UIRI和AAN（顶部）和UIRI及UUO模型（底部）AKI模型中处于细胞周期G2/M期的增殖（Ki-67阳性）肾小管细胞百分比，显示受损肾脏和对侧肾脏（对照）*P（P）< 0.001,#P（P）与对照组或假手术组相比<0.01(n个=每组每个时间点3只小鼠）。(d日)中度和UIRI组第7天肾脏与Ki-67（抗Ki-67）和p-H3（抗p-H3）抗体的联合免疫染色。(e（电子）)UIRI小鼠中p-H3和Kim-1抗体（抗Kim-1）的联合免疫染色。概述了管状基膜。(（f）)AKI肾脏分离小管中细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1的Western blot分析（顶部），以及细胞周期蛋白B1/细胞周期蛋白D1密度与β-肌动蛋白的比值（底部）*P（P）< 0.001. (克)在中度IRI、AAN和UUO组中，BrdU给药后不同时间处于G2/M的BrdU阳性肾小管细胞百分比*P（P）< 0.001. (小时)在杀死前12小时注射BrdU的中度IRI、AAN和UUO小鼠中，用BrdU和p-H3抗体染色，以及用DAPI染色细胞核。比例尺，50μm。误差线代表s.d。
图3
图3
G2/M阻滞的近端肾小管细胞中Profibrogenetic因子的产生在体外和AKI车型体内. (一)用碘化丙啶染色和流式细胞术分析基线时（前三张图）和马兜铃酸5μg ml处理后HK-2、LLC-PK1或IRPTC细胞的细胞周期−1持续48小时（底部三张图）。(n个= 10,n个=3和n个=分别针对这三种细胞类型进行3次实验。）(b条)5μg ml马兜铃酸（AA）处理的HK-2、LLC-PK1和IRPTC细胞中促纤维化基因mRNA水平的定量−148小时，表示为对照组的折叠增加(n个= 6,n个=3和n个=3个实验）*P（P）< 0.001, **P（P）与对照组相比<0.01。(c（c）)马兜铃酸处理HK-2细胞48小时后，上清液中TGF-β1浓度（左）和CTGF蛋白浓度（右）增加倍*P（P）< 0.001,#P（P）< 0.05. (d日)马兜铃酸治疗前后不同细胞周期阶段细胞中促纤维生成因子mRNA水平的变化(n个= 6). *P（P）< 0.01, **P（P）与对照组G0/G1相比<0.05；#P（P）< 0.01,##P（P）与对照组G2/M相比<0.05(e（电子）)G2/M-阻滞HK-2细胞条件培养基对血清饥饿成纤维细胞增殖的影响*P（P）< 0.05. (n个= 3.) (（f）)用来自对照细胞或G2/M阻滞的HK-2细胞的条件培养液处理的成纤维细胞中的胶原蛋白分泌（左）和IV型胶原蛋白生成（右。(n个= 3.) *P（P）< 0.01. (克)AKI模型中促纤维化因子的mRNA水平作为时间的函数，包括中度IRI、重度IRI、UIRI、AAN和UUO(n个=每组每个时间点3只小鼠）*P（P）< 0.001, **P（P）< 0.01,#P（P）与对照组或假手术组相比，<0.05（任意设置为1）。(小时)对中度IRI和马兜铃酸处理小鼠分离小管中TGF-β1和CTGF的Western blot分析。(我)CTGF或TGF-β1与p-H3共培养。细胞核（N）在顶部图像中进行了概述。比例尺，10μm。误差线代表s.d。
图4
图4
逆转G2/M期阻滞可挽救马兜铃酸处理的HK-2细胞和UIRI小鼠模型中的纤维生成效应。(一)第3天（左侧）所有模型每600×视野中p-ATM阳性的近端小管细胞数（Ser1981），以及中度IRI和AAN损伤（右侧，n个=每组每个时间点3只小鼠）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01,#P（P）<0.001与对照组或假手术组相比。(b条)马兜铃酸（AA）处理的HK-2细胞中p-ATM、p-Chk2（Ser68）和p-p53（Ser15）的Western blot分析。(c（c）)KU 55933（ATM抑制剂）对AA作用48小时后HK-2细胞（左）、LLC-PK1细胞（中）和IRPTC细胞（右）细胞周期变化（顶部）和促纤维化基因表达（底部）的影响(n个= 3). *P（P）< 0.01,**P（P）与对照组相比<0.05；#P（P）与AA相比<0.05(d日)在有或无ATM shRNA治疗的HK-2细胞和LLC-PK1细胞中的细胞周期分布（顶部）和促纤维生成因子产生（底部）。(n个= 3.) *P（P）< 0.01,#P（P）< 0.05. 细胞周期数据面板中的符号表示G2/M期的比较。(e（电子）)UIRI小鼠和在UIRI后10天接受对侧肾切除（N）或PIF-α治疗的UIRI鼠肾脏G2/M中增殖的肾小管细胞百分比*P（P）< 0.01. (（f）)整个肾脏的信使核糖核酸水平Tgfb1型,细胞生长因子,第4a1列和第1a1列对侧Nx或PIF-α治疗的UIRI小鼠*P（P）<0.01，与假手术组相比；#P（P）与UIRI相比<0.05(克)Nx或PIF-α治疗对UIRI肾脏间质纤维化程度的影响（UIRI损伤后42天检查），如Masson三色染色（左）和Sircol分析测定的胶原蛋白含量（右）所示。比例尺，50μm*P（P）< 0.01. 误差条代表标准偏差c（c）和d日，控制值按轨道设置为1。
图5
图5
由替代策略诱导的长时间G2/M期停搏可导致两种类型的纤维化前表型在体外和体内. (一)RO3306（RO）处理48小时后HK-2和LLC-PK1细胞的细胞周期变化(b条)RO3306作用24小时（RO24小时）或48小时（RO48小时）后，HK-2和LLC-PK1细胞的细胞周期变化（顶部）和纤维化前基因表达（底部）。(n个=3.）在一组中，RO3306药物在24小时后被洗净，24小时后检查细胞（RO 24小时/WO 24小时）**P（P）< 0.001, *P（P）< 0.01,#P（P）< 0.05. (c（c）)正常循环HK-2细胞（对照）、用RO3306处理24小时的细胞（RO 24小时）、用RO3306处理48小时的细胞（RO 48小时）和用RO3306处理48小时然后在RO3306冲洗后6小时收集的细胞周期分布（RO 48小时WO）（顶部）和促纤维化基因的mRNA水平：TGFB1型,CTGF公司,COL4A1系列和ACTA2公司G0/G1或G2/M相的细胞内（底部）(n个=3个实验）*P（P）< 0.001, **P（P）与对照组G0/G1相比<0.05；#P（P）< 0.001,##P（P）与对照组G2/M相比<0.05&P（P）<0.01与RO 48小时G2/M相比(d日)不同剂量紫杉醇作用24小时后HK-2细胞的细胞周期变化(n个= 3.) *P（P）< 0.001. (e（电子）)CTGF蛋白（top-western blot）和mRNA水平TGFB1型,CTGF公司,COL4A1系列和COL1A1公司（底部）用紫杉醇处理HK-2细胞24小时。n个= 5. *P（P）< 0.001. 对于mRNA水平b条和e（电子），控制值被任意设置为1。(（f）)未经紫杉醇治疗（>1天）或紫杉醇处理（>1天后）的中度IRI模型中增殖的肾小管细胞的细胞周期变化*P（P）< 0.01,#P（P）< 0.05. 细胞周期数据图中的符号表示G2/M期的比较。(克)经或不经紫杉醇治疗的中度IRI肾脏的Masson三色染色（损伤后21天，n个=每组3只小鼠）。比例尺，50μm。(小时)有或无紫杉醇治疗的中度IRI模型的血清肌酐变化。误差线代表s.d。
图6
图6
JNK信号激活介导G2/M阻滞诱导的促纤维化细胞因子上调。(一)马兜铃酸、RO3306或紫杉醇处理的HK-2细胞MAPK途径激活（顶部）和相应细胞周期分布（底部）的Western blot分析。(n个= 3–5.) (b条)JNK抑制剂（SP600125，SP）对马兜铃酸、RO3306（RO）或紫杉醇处理的HK-2细胞中细胞周期分布（顶部）和促纤维化基因表达（底部）的影响。(n个=3.）mRNA数据以未处理细胞的倍数诱导的形式呈现*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.001. 细胞周期图中的符号表示G2/M期的比较。(c（c）)与未处理的细胞（CON）相比，用马兜铃酸或马兜铃酸与SP600125（AA+SP）一起处理的HK-2细胞上清液中CTGF的蛋白质量。数据显示为控制单元上的折叠诱导(n个= 3). *P（P）< 0.001. (d日)用条件培养基（CM）培养经马兜铃酸处理的HK-2细胞或马兜铃酸和SP600125处理的HK-2-细胞的成纤维细胞增殖。(n个= 3.) *P（P）< 0.01. (e（电子）)用CM孵育的成纤维细胞上清液中的胶原蛋白含量（以相对于对照的百分比变化表示）来自马兜铃酸处理过的HK-2细胞或马兜铃酸和SP600125（SP）处理过的香港-2细胞。(n个= 3.) *P（P）< 0.01. (（f）)第7天，AAN肾脏中p-JNK或p-c-jun与p-组蛋白H3的共定标。比例尺，10μm。(克)UIRI术后第28天，对UIRI肾脏进行Masson三色染色，SP600125治疗或不治疗。比例尺，50μm。(小时)第28天肾脏间质纤维化定量评分（左）和胶原蛋白含量，由Sircol分析测定（右）*P（P）< 0.001,#P（P）< 0.05. (我)抑制JNK对UIRI治疗的肾脏中促纤维化基因表达的影响。数据显示为未处理细胞的折叠诱导*P（P）< 0.001,#P（P）< 0.05. 误差线代表s.d。
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中的注释

  • 纤维化停止。
    永利TA。 韦恩助教。 《国家医学》，2010年5月；16(5):523-5. doi:10.1038/nm0510-523。 《国家医学》，2010年。 PMID：20448575 免费PMC文章。

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