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。2010年4月30日；141(3):432-45.
doi:10.1016/j.cell.2010.03.030。

c-Myc调节转录暂停释放

彼得·B·拉尔 1, 查尔斯·Y·林, 艾米·塞拉, 瑞安·A·弗林, 斯科特·麦奎因, 克里斯托弗·B·伯格, 菲利普·A·夏普, 理查德·A·杨
附属公司

c-Myc调节转录暂停释放

彼得·B·拉尔等。 单元格。 。

摘要

通过特异性DNA-结合转录因子将RNA聚合酶II（Pol II）转录起始装置招募到启动子是基因表达的关键调控步骤。我们在此报告，启动子近端停顿是Pol II在哺乳动物细胞中转录的一个普遍特征，因此是基因表达调控的另一个步骤。这表明，一些转录因子将转录装置募集到启动子，而另一些则影响启动子近端暂停释放。事实上，我们发现转录因子c-Myc是细胞增殖的关键调节因子，在Pol II暂停释放中起主要作用，而不是在其靶基因中招募Pol II。我们讨论了这些结果对c-Myc扩增在人类癌症中的作用的影响。

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数字

图1
图1。Pol II的全基因组占用率
（A） 通过ChIP-seq分析确定mES细胞中RNA Pol II（全部）、RNA Pol II Ser5P和RNA Pol II Ser2P的占有率。代表性活性基因的富集（卢比3）和非生产性基因（第7页）如图所示。每个Pol II形式的全基因组结合平均值（内含子未描绘）显示在50bp的箱子中，以显示从转录起始位点上游2kb到每个注释基因末端下游2.5kb的转录单元的一般结合模式。（B） 描述用于确定mES细胞中每个Pol II结合基因的移动比率（TR）的计算的示意图。启动子近端bin使用注释起始位点周围−30bp到+300bp的固定窗口定义。转录区（基因体）bin从+300bp到注释端。TR是启动子近端bin中Pol II密度与转录区bin中Pol II密度的比值。（C）具有给定TR的Pol II结合基因的百分比分布。大约91%的基因的TR大于2，表明与下游转录区相比，大多数Pol II结合基因在启动子近端区域具有更多的Pol II。另请参见图S1。
图2
图2。P-TEFb抑制阻止启动子近端Pol II的释放
（A） mES细胞用1μM flavopiridol处理指定的时间。使用Pol II Ser2P、Spt5、Cdk9和Brg1抗体（用作负荷控制）通过Western blot分析提取物。**表示较高分子量的Spt5物种，如（Yamada et al.，2006）所述，对黄哌啶醇敏感。*表示分子量较低的Spt5物种。另请参见图S2A。（B） 用对照（DMSO 60分钟，黑色）或黄哌啶醇（1μM 60分钟，红色）处理的mES细胞的RNA Pol II（all）ChIP-seq分析。该面板显示了黄哌啶醇治疗后四个活跃转录基因的Pol II占用率的变化。另请参见图S2B。（C） 在flavopiridol处理和对照处理的mES细胞中活性基因的Pol II旅行比率分布（Pol II与H3K79me2修饰的核小体结合）。TR值越高，表示暂停程度越高。（D） mES细胞中非生产性基因的Pol II移动比率分布（Pol II结合但没有H3K79me2修饰的核小体），表明无论用对照药物还是黄哌啶醇治疗，非生产性基因组的TR分布都相对相同。
图3
图3。DSIF和NELF与Pol II共占大多数基因
（A） 使用ChIP-seq分析在一个代表性活性基因上结合Pol II（all）、NelfA（NELF亚基）、Spt5（DSIF亚单位）和Ctr9（PAF1亚单位）（卢比3）和非生产性基因（第7页）在mES细胞中。每个因子的全基因组结合平均值（内含子未描述）显示为50bp，以显示沿着RefSeq基因转录单位的一般结合模式，从转录起始位点上游2kb到每个注释基因末端下游2.5kb。（B） 所有小鼠RefSeq基因的Pol II（全部；灰色）、NelfA（橙色）、Spt5（绿色）和H3K4me3（紫色）的ChIP-seq结合的热图表示，从大多数Pol II排列到最低Pol II。颜色意味着丰富，白色意味着没有丰富。另请参见图S3。（C） Spt5、NelfA和H3K4me3峰与每个富集Pol II基因的启动子近端Pol II峰之间的距离的空间分布，表明与Spt5，NelfA及Pol II峰值大致重叠。（D） ChIP-seq结合图显示Pol II（all）、Spt5（DSIF）、NelfA（NELF）、延伸相关染色质修饰（H3K79me2）和TSSa-RNA在双向启动基因处读取到该基因组区域的地图（Hsd17b12）和单向启动基因（卢比6）.红色箭头表示在反义方向映射到基因的TSSa-RNA物种，蓝色箭头表示在感观方向映射到该基因的TSSa-RNA物种。
图4
图4。DSIF基因敲除改变Pol II在许多基因上的占有率
（A） 通过使用Spt5或NelfA抗体的Western blot测定所示shRNA-介导的mES细胞敲除后的Spt5（左）和NelfA（右）蛋白水平。β-管蛋白是一种负荷控制。（B） shControl（黑色）、shSpt5（橙色）和shNelfA（蓝色）mES细胞中五个活性基因的RNA Pol II（all）ChIP-seq结合密度分析。（C） shControl、shSpt5和shNelfA mES细胞中的RNA Pol II TR计算表明，许多基因在Spt5敲除后变得不那么暂停，而在NelfA敲除后发生更微妙的变化。较低的TR值表示暂停程度较低。另请参见图S4。
图5
图5。c-Myc靶基因富含活性转录基因，c-Myc/Max与mES细胞中的P-TEFb相关
（A） 使用针对IgG（测量背景结合）或内源性c-Myc、Max、Cdk9和CycT1的抗体在mES细胞中进行协同免疫沉淀实验。从mES细胞裂解物中免疫预处理蛋白质，并通过检测Max、Cdk9和CycT1进行Western blot分析。对Max和Cdk9印迹加载10%的输入，对CycT1印迹加载1%的输入。（B） 热图表示说明了c-Myc、Oct4和Nanog靶基因在mES细胞中的转录状态，如Pol II Ser5P、H3K4me3（启动相关染色质修饰）、H3K79me2（延伸相关染色质修改）和H3K27me3（抑制性染色质修饰。根据每个基因的Pol II结合量对每个目标基因集进行排序，从Pol II的最高量到最低量，指示的染色质修饰或Pol II在每个注释的转录起始位点周围的富集显示为-2.5kb到+3kb。蓝色表示浓缩，白色表示不浓缩。（C） C-Myc靶基因的TR值低于非靶基因。对具有给定TR值的高置信度c-Myc靶基因和非靶基因的基因数量绘制直方图。TR值较低的基因比TR值较高的基因暂停时间短。另请参见图S5。
图6
图6。c-Myc抑制在暂停释放阶段影响转录
（A） 从10058-F4或单独载体（DMSO）处理6小时的mES细胞中提取RNA，并使用逆转录生成cDNA。从两个独立实验中计算10058-F4处理的细胞的表达变化，并将两个非c-Myc靶基因（Brg1、Rnf2-绿色）和五个c-Myc目标基因（Bax、Nol5、Zfp451、Brca2和Atic-blue）与单独对照进行比较。误差条表示三次qPCR反应的标准偏差。（B） 用10058-F4处理mES细胞1.5、6或12小时。使用抗Pol II Ser2P CTD和Pol II Ser5P CTD抗体对提取物进行Western blot分析，以确定Pol II修饰形式的水平。TBP用作负荷控制。（C） 10058-F4（C-Myc/Max抑制剂；蓝色）、DMSO单独（黑色）或黄哌啶醇（P-TEFb抑制剂；红色）处理的mES细胞中Pol II ChIP-seq结合谱。显示了三个c-Myc靶基因的Pol II占有率(Ncl公司,Npm1号机组和第5号)和两个非cMyc靶基因(Txnip公司和Chpf2公司). 用10058-F4或DMSO处理细胞6小时。另请参见图S6。（D） 非药物（黑色）和10058-F4治疗（蓝色）中高置信度cMyc靶基因和非c-Myc靶蛋白基因的平均Pol II结合图。左侧面板显示了整个基因的平均值。右侧面板是转录区的特写，显示了不同条件下伸长Pol II密度的差异。右侧面板中还包括在flavopiridol治疗后延长Pol II密度的比较（红色）。（E） 10058-F4治疗（蓝色）或非药物治疗（黑色）后高置信度c-Myc靶基因和非c-Myc目标基因的Pol II移动比率（TR）。左侧面板是c-Myc目标的TR，右侧面板是非c-Myc靶的TR。TR值越高，表示暂停程度越高。
图7
图7。Oct4停堆减少Oct4依赖基因的Pol II启动
（A） 在多西环素治疗0、12或24小时后，多西环素诱导的Oct4敲低mES细胞中的Oct4蛋白水平。用Oct4抗体对提取物进行检测。Brg1用作加载控制。（B） 在强力霉素治疗的指定时间后，Pol II ChIP-seq在Oct4靶基因上的结合谱，诱导Oct4敲除。值得注意的是，Oct4结合基因改变了启动子近端区域和转录区域中Pol II的占有率。右边的面板显示了多西环素治疗指定时间后非Oct4靶点的Pol II ChIP-seq结合谱，诱导Oct4敲除。（C） 在多西环素治疗0或12小时后，高置信度Oct4依赖性基因和Oct4非靶基因的Pol II旅行比（TR）如图1C所示。左侧面板是Oct4目标的TR，右侧面板是非Oct4的TR。
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中的注释

  • c-Myc对RNA聚合酶II伸长的调节。
    价格DH。 价格DH。 单元格。2010年4月30日；141(3):399-400. doi:10.1016/j.cell.2010.04.016。 单元格。2010 PMID：20434979
  • 为Myc故事添加更多内容。
    斯瓦米M。 斯瓦米M。 Nat Rev癌症。2010年7月；10(7):455. doi:10.1038/nrc2879。 Nat Rev癌症。2010 PMID：20589974 没有可用的摘要。

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