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.2010年5月；51(5):1712-23.
doi:10.1002/hep.23525。

Hedgehog信号对小鼠肝部分切除术后正常肝再生至关重要

贝戈尼亚·奥乔亚 1, Wing-Kin同步, 伊戈茨·德尔加多, 游戏F卡拉卡, 容美美（Youngmi Jung）, 王江波, 安娜·M·祖比亚加, 奥拉兹·弗雷斯内多, 阿莱西亚·奥梅内蒂, 马尔泽娜·兹达诺维茨, 史蒂夫·S·崔, 安娜·梅·迪尔
附属公司

Hedgehog信号对小鼠肝部分切除术后正常肝再生至关重要

贝戈尼亚·奥乔亚等。 肝病学. 2010年5月.

摘要

不同的机制被认为在胎儿发育期间和成人损伤后调节肝脏的生长，因为前者依赖于祖细胞，后者通常涉及成熟肝细胞的复制。然而，成人慢性肝损伤增加了Hedgehog（Hh）配体的生成，这是一种控制祖细胞命运和协调胚胎发生期间组织构建各个方面的发育形态原。这增加了类似的Hh依赖机制也可能调节成人肝脏再生的可能性。目前对70%部分肝切除（PH）后小鼠肝再生的分析表明，PH诱导肝细胞产生Hh配体并激活Hh信号。用特异性Hh信号抑制剂治疗会干扰正常肝脏再生的几个关键成分，显著抑制祖细胞反应、基质重塑、肝细胞和导管细胞的增殖以及肝脏质量的恢复。这些对肝再生的全局抑制作用显著降低了PH后的存活率。

结论：介导肝脏器官发生的机制，如Hh途径激活，被保留并促进成人肝脏损伤后的重建。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露：作者声明他们没有利益冲突或财务利益。

数字

图1
图1。肝部分切除术（PH）后Hedgehog通路的激活
对102只小鼠进行PH；在PH后6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h和216h处死6–12只小鼠/组。采集静止（0h）肝脏和再生肝脏，用qRT-PCR检测每只小鼠的总RNA三次，以检测（A）Hh通路信号成分、Hip、Ihh、Shh、Ptc/Smo、Gli1和Gli2，以及（C）sFRP1（Hh靶基因）。结果表示为相对于0h肝组织的折叠变化；绘制了平均值±SEM。使用单向方差分析将数据分为复制前、复制后和复制后数据集进行统计分析。（B） 在PH后48小时处死的3只随机挑选的小鼠的0小时和PH后肝脏中Gli蛋白表达的代表性Western blot分析。使用β-actin作为负荷对照；斑点致密化；每个样本中的Gli表达归一化为β-actin表达；将累积数据绘制成图表*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001 vs 0h。
图2
图2。PH后肝上皮祖细胞标志物的变化
在图1所示的所有102只小鼠中检测了PH对祖细胞标记mRNA水平的影响。（A） Fn14、Tweak、Afp的QRT-PCR分析。结果表示为相对于0h肝组织的折叠变化；绘制了平均值±SEM。数据被分为预复制、复制和复制后数据集，以进行统计分析*相对于时间0h，P<0.05或**P<0.01或***P<0.001（ANOVA）。（B） 采用免疫组织化学方法对随机选择的小鼠在PH后12h、24h或48h（n=4只小鼠/时间点）处死的0h和PH后肝脏中的其他两个祖细胞标记物AE1/AE3和Mpk2进行评估。将显示具有代表性的部分。AE/AE3或Mpk2染色的细胞呈棕色。
图3
图3。PH后纤维生成的变化
在图1所示的所有102只小鼠中检测了PH对纤维生成标记物mRNA水平的影响。（A） α-sma和胶原蛋白的QRT-PCR分析。结果表示为相对于0h肝组织的折叠变化；绘制平均值±SEM。数据分为复制前、复制后和复制前数据集，以进行统计分析*相对于0h，P<0.05或**P<0.01或***P<0.001（方差分析）。（B） 组织化学用于检测在PH后24小时、48小时、72小时或168小时处死的随机选择小鼠（n=4只小鼠/时间点）0小时和PH后肝脏中α-sma（+）细胞和胶原纤维的肝蓄积。对于α-SMA形态测量，使用Metaview软件对15个随机选择的40×场/截面进行分析；天狼星红染色在20×场中进行了类似评估。绘制平均值±SEM结果*与车辆处理小鼠相比，P<0.05或**P<0.01（Student’st吨-测试）。（c） 显示α-SMA染色细胞（棕色）或天狼星红染色胶原原纤维的代表性切片。
图4
图4。肝部分切除术后肝细胞和胆管细胞具有Hh反应性和增殖性
（A） 随机选择小鼠，在PH后0h和24h～168h的不同时间点（n=4只小鼠/时间点）从肝脏切片中计数含有Gli2（+）核的细胞。PH后0h和48h代表性肝脏切片的Gli2染色（放大400倍）；绘制了Gli2（+）肝细胞的平均±SEM百分比和每个门静脉道Gli2的导管细胞数量*P<0.05 vs 0小时（学生t吨-测试）。（B） 其他小鼠接受假手术（n=2）或PH（n=4），24小时或48小时后取肝细胞；使用蛋白质印迹分析评估每个分离物中Hh调节的转录因子（Gli1、Gli2）、Hh配体（Shh、Ihh）和K7（祖细胞标记物）的表达。β-actin作为负荷对照。（c） 代表性显微照片显示肝细胞和导管细胞在PH后48小时和72小时进行了BrdU核染色。小插页显示0小时肝脏中没有BrdU染色。为了量化BrdU染色，随机选择15个20×场/节进行评估。所有小鼠的组织均用于分析。绘制平均值±SEM*P<0.05或**P<0.01 vs 0h（学生的t吨-测试）。
图5
图5。抑制Hedgehog信号可损害PH后Hh信号的诱导、肝祖细胞的积累和纤维化
在PH前和PH后q24h用环磷酰胺（Hh抑制剂或载体）治疗小鼠；然后进行12小时（n=10）、24小时（n=20）、48小时（n/20）和72小时（n=50). 在牺牲前2小时注射BrdU以评估增殖活性。（A） Gli1、Gli2和sFRP1 mRNA在所有存活的载体（白条）或环磷酰胺（实心条）治疗小鼠中的表达。数据以平均值±扫描电镜（SEM）表示。（B）在PH后48小时，对从环胺或车辆治疗组随机选择的小鼠肝脏中获得的肝蛋白进行Western blot分析。每条通道都包含来自单个小鼠的蛋白。斑点致密化；Hh相关基因表达在每个样本中均归一化为β-肌动蛋白表达；绘制平均值±SEM数据*P<0.05或**P<0.01 vs 0h（学生的t吨-测试）。（C） 在PH后48小时，对环磷酰胺或车辆治疗组的所有小鼠的祖细胞标记进行QRT-PCR和Western blot分析。Western blot的每一条路线都包含4-6只小鼠/治疗组的蛋白质。β-肌动蛋白作为负载对照。（D） 来自每个治疗组的4只随机挑选的小鼠的PH后48小时切片也进行了染色，以显示表达其他祖细胞标记物AE1/AE3和Mpk2的细胞。显示了具有代表性的部分。祖细胞标记的细胞染色为棕色。（E） 在48小时时对来自环磷酰胺或车辆治疗小鼠的所有存活小鼠进行纤维生成标记物分析。α-sma和胶原蛋白1α1 mRNA表达的QRT-PCR分析；α-SMA蛋白表达的Western blot分析；天狼星红染色的形态计量分析。
图6
图6。抑制Hedgehog信号抑制PH后肝细胞和导管细胞的增殖
（A） 图5所示的所有存活的环磷酰胺或载药小鼠肝切片中每个场的BrdU（+）肝细胞百分比和每个门静脉道的BrdU（+）导管细胞数量*P<0.05，**P<0.01与可比较的经车辆处理的对照组（学生的t吨-测试）。（C） 环胺对原代肝细胞增殖活性的直接影响。另外两对小鼠接受了假手术或PH；24小时后分离肝细胞，并在BrdU±tomatidine（非活性环胺类似物）或环胺（5µM）存在下培养过夜；每个治疗组的BrdU掺入量通过ELISA在四个平板上进行评估。将环胺处理培养物中的平均值±SEM BrdU掺入量归一化为相应的托马汀处理培养物的结果*P<0.05，与可比的经tomatidine治疗的对照组相比（Student’st吨-测试）。环磷酰胺对假手术小鼠肝细胞中BrdU掺入没有影响（数据未显示）。
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