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。2010年5月11日；121(18):2033-44.
doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.109.895037。 Epub 2010年4月26日。

肿瘤坏死因子受体相关因子1（TRAF1）缺陷通过损害单核细胞向血管壁的募集减轻小鼠动脉粥样硬化

安娜·米西欧 1, 娜塔莎·科斯特林, 内雷亚·瓦罗, 菲利普·鲁道夫, 彼得·艾切尔, 桑德拉·恩斯特, 克里斯蒂安·穆克尔, 卡琳娜·沃尔特, 彼得·斯塔科恩, 本杰明·索默, 迪特马尔·菲弗, 卡贾·齐利克, 林赛·麦克法兰, 丹尼斯 沃尔夫, 埃尔丁尼·齐齐科夫, 克里斯托夫·博德, 利比, 安德烈亚斯·齐利克
附属公司

肿瘤坏死因子受体相关因子1（TRAF1）缺陷通过损害单核细胞向血管壁的募集减轻小鼠动脉粥样硬化

安娜·米西欧等。 循环。 。

摘要

背景：肿瘤坏死因子超家族成员，如肿瘤坏死因子α，能有效促进小鼠和人类的动脉粥样硬化形成。肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）是这类细胞因子的细胞质适配器蛋白。

方法和结果：本研究验证了TRAF1调节体内动脉粥样硬化的假说。与低密度脂蛋白受体缺乏（LDL受体缺乏）对照动物相比，摄入高胆固醇饮食18周的TRAF1（-/-）/LDLR（-/--）小鼠的动脉粥样硬化病变明显更小。TRAF1缺乏动物的斑块中巨噬细胞数量显著减少，这是组织学组成中最显著的变化。骨髓移植显示，造血细胞和血管常驻细胞中TRAF1的缺失有助于减少动脉粥样硬化的发生。力学研究表明，在静态和动态分析中，内皮细胞和单核细胞中TRAF1的缺乏降低了炎症细胞与内皮的粘附。粘附受损与巨噬细胞中细胞扩散、肌动蛋白聚合和CD29表达减少以及内皮细胞中粘附分子细胞间粘附分子-1和血管细胞粘附分子-1表达减少有关。人类细胞中的小干扰RNA研究证实了这些发现。此外，急性冠脉综合征患者血液中TRAF1信使RNA水平显著升高。

结论：TRAF1缺陷可减弱小鼠的动脉粥样硬化形成，这很可能是由于血管壁的单核细胞募集受损所致。这些数据表明TRAF1是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突披露：

Anna Missiou-无需披露

Natascha Köstlin-无需披露

Nerea Varo-无需披露

菲利普·鲁道夫-无需披露

Christian Münkel-无需透露

桑德拉·恩斯特-无需披露

Carina Walter-无需披露

Peter Stachon-无需披露

本杰明·索默-无需披露

Dietmar Pfeifer-无需披露

Katja Zirlik-无需披露

林赛·麦克法兰-无需披露

丹尼斯·沃尔夫-无需披露

Erdyni Tsitsikov-无需透露

Christoph Bode-无需披露

Peter Libby-无需披露

Andreas Zirlik-无需披露

数字

图1
图1。TRAF1缺陷减轻小鼠动脉粥样硬化
A和B.TRAF1−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−小鼠连续18周和8周摄入高胆固醇饮食，对主动脉根部（a）和主动脉弓（B）的内膜病变大小进行分析（N=8和13）。合并数据±SEM显示在左侧；右侧显示了脂质沉积染色的代表性切片（Oil-red-O）的图像。C.对上述处理的小鼠主动脉弓切片进行巨噬细胞、平滑肌细胞、脂质和胶原蛋白特异性染色分析。Mac-3-、α-肌动蛋白-、油红-O-和皮氏菌红阳性染色与总壁面积的关系显示为平均值±SEM（N=8和13）。
图2
图2。TRAF1缺乏骨髓源性和常驻细胞可减轻小鼠动脉粥样硬化
在TRAF1之间进行骨髓移植−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−老鼠。对连续18周食用高胆固醇饮食的嵌合体进行主动脉根部内膜病变大小分析。合并数据表示平均值±SEM。Mac-3-（巨噬细胞）、α-肌动蛋白-（平滑肌细胞）、CD4-（T细胞）、油红-O-（脂质）和皮氏红（胶原）阳性染色与总壁面积的关系显示为平均值±SEM（N=8和5）。
图3
图3。TRAF1缺陷损害单核细胞与内皮细胞的粘附并减弱小鼠巨噬细胞的扩散
A.用CFDA对TRAF1缺陷小鼠和野生型小鼠的单核细胞和PBMC进行染色，并允许其与从TRAF1缺陷鼠和野生型鼠（N=3）分离的小鼠内皮细胞相互作用。在显微镜下计数粘附细胞。每个符号表示一个单独的实验和捐赠者。B.在流动条件下（0.5达因/cm），利用从TRAF1缺陷小鼠和野生型小鼠分离的TNFα激活的内皮细胞分析从TRAF1缺乏小鼠和野生小鼠中获得的PMA激活的巯基乙酸合法腹膜白细胞的粘附性2，N=5）。粘附白细胞在显微镜下定量。汇集的数据代表平均值±SEM。C.在活体显微镜检查前4h，用200ng TNFα腹腔注射小鼠。对提睾肌的静脉（30–50µm）进行白细胞粘附筛选。人工计数粘附白细胞的数量。数据表示平均值±SEM。D.将野生型和TRAF1缺陷小鼠的巨噬细胞接种在涂有血清的玻璃盖玻片上，并在37°C下孵育。细胞用Alexa Fluor 594结合的卵磷脂染色，并进行共聚焦显微镜。扩散被量化并表示为左侧扩散细胞的平均值±SEM（每个N=5）；代表性图片显示在右侧。
图4
图4。TRAF1缺陷减弱小鼠内皮细胞和巨噬细胞上粘附分子和整合素的表达
A.用TNFα（20ng/ml）、CD40L（10µg/ml）和IL-1β（10ng/ml。顶部显示了针对GAPDH调整后的混合密度测量数据（平均值±SEM），下面是代表性的斑点。B.TRAF1的动脉组织−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−分离小鼠，通过Western blotting检测裂解物中VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达。针对GAPDH表达调整的数据。数据显示为分组散点图。代表性斑点如下所示（N=3）。C.TRAF1主动脉根部的切片−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−高胆固醇饮食18周的小鼠进行了VCAM-1和ICAM-1表达的免疫组织化学分析。VCAM-1-（N=6和10）和ICAM-1-。D.用TNFα（20ng/ml）刺激从TRAF1缺乏小鼠和野生型小鼠获得的小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMM）24小时，并用Western blotting分析细胞裂解物中的CD29（N=4）和CD11b（N=3）。根据GAPDH调整的汇集密度计数据，如分组散点图所示，代表性印迹如下。
图5
图5。TRAF1缺陷可差异调节趋化因子和趋化因子受体的表达，但不会改变炎症细胞的迁移
A.使用或不使用TNFα（20ng/ml）´刺激从TRAF1缺陷小鼠和正常小鼠分离的小鼠内皮细胞24小时。ELISA检测上清液中的Kc（CXCL-1）和MIP-2（CXCL2）蛋白（N=8和7）。数据以平均值±SEM和分组散射斑点形式给出。B.使用或不使用TNFα（20ng/ml）刺激TRAF1缺陷和活性小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMM）。用ELISA法测定上清液中的CXCL-1蛋白，用Western blotting法测定细胞裂解液中CXCR-1的表达（N=6和3）。数据以平均值±SEM和根据GAPDH±SEM调整的密度计平均值的形式给出，并以分组散点图的形式给出，在适当的情况下，代表性的蛋白质印迹如下所示。C.TRAF1的小鼠单核细胞−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−通过FACS分析食用高胆固醇饮食的小鼠的CXCR2、CCR5、CXCR3和CCR7表达（每个N=3）。数据表示分组分散杂交中的百分比±SEM。D.在改良的Boyden室（N=3只）中，检测从TRAF1缺陷小鼠和正常小鼠分离的PBMC对指示浓度的CXCL-1、MCP-1和CXCL-2的迁移能力。迁移的PBMC在显微镜下定量，并以负载细胞的百分比表示。
图6
图6。TRAF1缺陷下调炎症细胞因子，但不影响巨噬细胞分化和细胞凋亡
A.TRAF1血清−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−在基线检查时和高胆固醇饮食18周后，对小鼠进行TNFα、IL-1β、IL-6和IL-1α的分析。数据表示平均值±SEM（每组10和16个）B。骨髓源性巨噬细胞（BMM）固定在TRAF1的盖玻片和脾脏切片上−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−用分化标记物FA-11和F4/80对小鼠进行染色（N=3只）。同样，TRAF1主动脉弓的动脉粥样硬化斑块切片−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−喂食高胆固醇饮食18周的小鼠被标记为增殖标记物Ki-67（N=6和13）。代表性图片显示在顶部。对每100个计数细胞中的FA-11、F4/80和Ki-67阳性细胞进行量化、汇总，并以分组散点图的形式给出。C.交通1−/−/低密度脂蛋白受体−/−和TRAF1+/+/低密度脂蛋白受体−/−小鼠连续18周摄入高胆固醇饮食。主动脉根部切片采用TUNEL分析。TUNEL阳性染色与总壁面积的关系显示为平均值±SEM（N=5和13）。
图7
图7。TRAF1缺陷不会改变一般免疫反应
（A） 分析脾细胞体外CD4和C8 T细胞及其活化（CD44你好，第62页洛)和增殖标记物（KLRG-1你好). （B） 用αCD3/αCD28激活脾细胞3天，并测定细胞内TNFα和IFNγ。检测上清液中的IL-6、IL12p70和IL-10。（C） 检测高胆固醇饮食小鼠的血清IFNγ、IL-2、IL12p70、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13。此外，在动脉粥样硬化和TNFα刺激小鼠的动脉组织以及TNFα激发小鼠的血清中评估IFNγ、IL12p70和IL-10。数据表示平均值±SEM。
图8
图8。EC和单核细胞中TRAF1的表达限制了粘附分子和整合素的表达，人类急性冠脉综合征中TRAF1 mRNA的表达增加
A.用TRAF1特异性或打乱的siRNA转染人脐内皮细胞和人单核细胞。用TNFα（20ng/ml）刺激细胞24小时，内皮细胞中VCAM-1和ICAM-1（各4个）的表达水平，以及通过Western blotting分析的人单核细胞核中整合素β1（CD29）和CXCR1（各3个）的表示水平。针对GAPDH调整后的密度测定结果显示为顶部的平均值±SEM，以及下面的分组散射斑点和代表性斑点。325例接受冠状动脉造影的患者被分为三组：无冠心病（no CHD）、稳定型冠心病（CHD）和急性冠脉综合征（ACS）。通过实时定量PCR分析全血RNA中TRAF1和GAPDH mRNA。使用连续变量的Spearman相关系数评估TRAF1水平与所有变量的单变量相关性。结果以平均值±标准误差的形式表示，该误差是根据各组的平均测量值计算得出的。
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