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.2010年4月2日；6(4):323-335.
doi:10.1016/j.stem.2010.02.015。

MicroRNA-9协调人类胚胎干细胞衍生神经祖细胞的增殖和迁移

塞琳·德拉洛伊 1, 刘雷（Lei Liu） 1, 李进阿 1, 华素 2, 沈繁霞 2, 杨国元 2, 威廉·L·杨 2, 凯西·N·艾维 三, 汾标高 4
附属公司

MicroRNA-9协调人类胚胎干细胞衍生神经祖细胞的增殖和迁移

塞琳·德拉洛伊等。 细胞干细胞. .

摘要

人类多能干细胞有望用于脑损伤和疾病的细胞治疗。然而，人们对它们的细胞行为知之甚少。在这里，我们显示了脑特异性microRNA-9（miR-9）在来源于人类胚胎干细胞的人类神经祖细胞（hNPC）中的表达被激活。miR-9的缺失抑制体外培养的hNPC的增殖，但促进其迁移。不具有miR-9活性的hNPC移植到小鼠胚胎脑或中风小鼠模型的成年脑中时，也表现出迁移增强。这些影响不是由于hNPC的早熟分化所致。miR-9直接调控的关键靶点之一编码stathmin，增加微管不稳定性，其在hNPC中的表达与miR-9的表达呈负相关。stathmin活性的部分抑制抑制了miR-9缺失对人类或胚胎大鼠神经祖细胞增殖和迁移的影响。这些结果表明miR-9是一种新的调节因子，可以协调hNPC的增殖和迁移。

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数字

图1
图1。人胚胎干细胞神经分化过程中MiR-9的表达
（A） 人胚胎干细胞神经分化不同阶段细胞的相控图像。hESCs（H9系）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞上存在FGF2的情况下维持。DIV 0是指hESC与MEF分离的日期。最初的分化是由EB的形成诱导的，然后是在FGF2和N2补充物存在下的神经诱导。神经外胚层细胞的玫瑰花结形成菌落出现在13-16 DIV。玫瑰花丛中的神经祖细胞在16-46 DIV的悬浮培养中分离和扩增，形成神经球。分离的神经前体细胞暴露于BDNF和GDNF，以43-60 DIV的比例尺（100μm）分化为神经元。（B） qRT-PCR监测神经分化不同阶段细胞标记的表达谱。上的值x个-悬浮培养人胚胎干细胞后，轴为DIV。表达标准化为GAPDH水平，给定标记的最高水平总是取100。数值为至少三种独立培养物的平均值±标准偏差。NANOG公司和华侨城4号是多生性ESCs的标志物。SOX2标准和PAX6在神经祖细胞中表达，并且地图2是成熟神经元的标记。（C） 干细胞中高度富集的miRNA miR-367的表达谱；miR-124，一种在有丝分裂后神经元中高度富集的miRNA；miR-9、miR-9*和pre-miR-9-2，在hESCs的神经分化过程中产生miR-9和miR-9*。（D-M）人胚胎干细胞神经分化过程中MiR-9表达的原位分析。（D-F）miR-9在SOX2阳性花环结构中不表达，如SOX2-免疫阳性细胞中缺少miR-9原位标记所示。（G） 原位标记的绿色信号表明miR-9在神经球中强烈表达。（H-J）杂乱对照探针作为阴性对照，显示玫瑰花结结构中SOX2阳性细胞的背景原位标记。（K） 扰乱的对照探针没有标记神经球中的hNPC。（L） miR-9（如绿色所示）在MAP-2阳性的人类神经元中表达（如红色所示）。（M） miR-9（如绿色所示）在S100b阳性星形胶质细胞中也低水平表达（如红色所示）。另请参见图S1。
图2
图2。MiR-9是促进早期神经前体细胞增殖所必需的
（A，B）将补充miR-9的LNA-抗miR-9探针引入16 DIV分离的人NPC中，从玫瑰花结分离并悬浮培养。用抗miR-9或对照干扰探针转染后24、48和96 h，通过qRT-PCR测定成熟miR-9（A）和miR-9*（B）的相对水平。（C） 用打乱或抗miR-9探针转染的hESC衍生神经球的相控图像。比例尺，100μm。（D） 转染5天后神经球直径。上的数字x个-轴表示测量的神经球数量。数值为平均值±s.e.m.（e）TUNEL染色表明miR-9的丢失不会影响人类神经祖细胞的存活。给出了TUNEL染色的量化和代表性图像。（F） MiR-9敲除对hNPC没有细胞毒性作用。用打乱的LNA探针或抗miR-9 LNA探针在16 DIV下模拟转染或转染hESC衍生的神经前体细胞。在LDH检测细胞毒性48 h和转染后96 h前20 h更换培养基。注：不重要。数值为平均值±s.e.m.（G）当miR-9被敲除时，hNPC和大鼠NPC中BrdU掺入量减少。显示转染后3天BrdU阳性细胞的百分比。数值为平均值±标准误差**P（P）< 0.01 (n个=3）。（H） 用LNA-anti-miR-9或打乱探针在16 DIV神经元分化时转染hNPC。24小时后收集神经球，并在96个钢板中分离。在这个时间点和每天使用WST-1增殖试验测量代谢活性（Abs.450 nm）。将每个时间点的平均吸光度标准化为转染后第1天的值。数值为每个时间点和每个条件下8至16个井的平均值±s.e.m*P（P）< 0.05. 另请参见图S2。
图3
图3。miR-9功能丧失延迟早期神经祖细胞成熟
免疫染色显示，（A-I）MiR-9敲除不会导致大鼠胚胎NPC的早熟分化。（A） 核染色显示的神经球期所有人类细胞中表达给定标记的细胞比例。hNPC转染7天后，打乱和抗miR-9转染细胞之间没有观察到差异。（B-I）神经前体标记物nestin（B，D）和神经元标记物TUJ1（F，H）在对照组或抗miR-9转染的hNPC中的表达。C、 E、G和I的细胞核染色为蓝色。（J） 神经祖细胞分子标记表达水平的qRT-PCR分析。用打乱或抗miR-9 LNA探针转染三天后，从新形成的神经球细胞中提取总RNA，并进行qRT-PCR分析。分析的标记物包括神经干细胞（PAX6、SOX2）共有的标记物，特异于神经祖细胞的早期状态（PLAGL1、DACH1、PLZF），在神经母细胞（TUJ1、DCX、NEUROD1、MAP1B）中表达，特异于前部（OTX2、EMX2、FOXG1）或后部（GBX2、HOXB4、EGR2）身份，少突胶质细胞前体标记物（CSPG4），和神经源性因子（MEF2C）。转染抗miR-9 LNA探针三天后，PAX6和SOX2水平升高，而MEF2C水平降低，表明成熟延迟。然而，没有观察到向前后一致性转变，成神经细胞标记物不受miR-9功能丧失的影响。确实，当miR-9被抑制时，早期NPC标记物的表达水平没有改变。因此，miR-9活性的丧失不会导致神经祖细胞的过早分化。事实上，这表明功能丧失延缓了hNPC向更成熟的神经元祖细胞的发展。数值为平均值±标准误差*P（P）<0.05. 另请参见图S3。
图4
图4。MiR-9限制hNPC体外迁移
（A-D）miR-9敲除导致大鼠NPC从塑料基底上的神经球迁移。转染干扰对照（A，B）或抗miR-9（C，D）后，将细胞培养72 h和144 h。（E） 从神经球边缘到迁移细胞最远细胞核的距离。数值为平均值±s.e.m.（F）具有或不具有miR-9活性的迁移细胞数量。数值为平均值±标准误差。在面板e和F中，每列显示了所分析的神经球数量。（G-L）miR-9敲除导致hNPC从培养在3D基质中的神经球中早熟迁移；指出了时间嵌入。（M） 从神经圈边缘到向外迁移细胞最远细胞核的距离。数值为35个对照组和45 miR-9转染的神经球在24小时和42个对照组以及43个转染的神经球在48小时的平均值±标准偏差。参见图S4。
图5
图5。hNPCs在小鼠脑卒中模型的胚胎脑切片和成年脑中的迁移
（A） E14.5前脑切片培养中的大脑示意图。（B） 将来源于人胚胎干细胞的扰乱的LNA探针转染的神经球移植到内侧神经节隆起（MGE）。比例尺，50μm。（C） 在MGE中移植miR-9敲除的hESC衍生神经球。箭头表示一些迁移的hNPC。（D） hNPC迁移出神经球的最大距离。数值为五次最长迁移的平均值±标准偏差。量化方法在实验程序中描述。每一栏显示了一个实验中移植的神经球数量。这个实验又重复了两次，结果相似。（E） 中风小鼠模型纹状体中移植hNPC向脑损伤区域迁移的分析。用抗人线粒体抗体（hMit）染色后，对每只小鼠不同取样区域（距离移植hNPC 0–200、201–400、401–600和>600μm）的hNPC进行计数。（F） 用扰乱的LNA探针转染的hNPC大部分保留在注射部位。棒材：200μm。（G） 一些抗miR-9转染的hNPC从注射部位向损伤部位迁移。箭头表示一些迁移的hNPC。（H） 每个区域迁移hNPC的百分比（n=8只/组）。数值为平均值±标准误差*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 另请参见图S5和S6。
图6
图6。Stathmin作为MiR-9直接调控的关键mRNA靶点的鉴定
（A） miR-9表达谱的qRT-PCR分析预测了hESCs神经元分化过程中的mRNA靶点。表达标准化为GADPH mRNA水平。值是来自至少三种不同文化的平均值±标准偏差。另见表S1-S4。（B） 用抗miR-9和干扰对照探针转染hNPC 24 h后miR-9预测靶点mRNA表达水平的qRT-PCR分析。数值为五个实验的平均值±标准偏差，标准化为对照转染hNPC的水平。（C） Western blot分析显示抗miR-9转染24 h后hNPC中stathmin、CHMP2B和SIRT1的表达水平。Actin充当加载控件。该分析重复了三次。数值是这些蛋白质表达水平的平均倍数变化。（D） 转染前miR-9-2 48 h后HEK293细胞中miR-9预测靶点的表达水平。miR-124前体转染HEK293细胞作为阴性对照。（E） 人类stathmin 3′UTR中潜在miR-9结合位点的序列互补性。强调了荧光素酶分析控制实验中突变的三个核苷酸。（F） 人类、大鼠和小鼠stathmin 3′UTR中的保守核苷酸与miR-9的核苷酸1-7、9-11和12-15互补（灰色）。（G） 含有stathmin野生型或突变型3′UTR的构建物的相对荧光素酶活性在对照或前miR-9-2存在下共同转染到HEK293细胞。转染后48小时测量萤火虫萤光素酶活性，并将其标准化为共转染的雷尼拉萤光素酶构建体。野生型fl：野生型全长stathmin 3′UTR。WT-bs：野生型部分stathmin 3′UTR，包含推测的miR-9结合位点。MUT-bs：部分stathmin 3′UTR，在推测的miR-9结合位点有突变的种子区域。对于所有面板*P（P）< 0.05. **P（P）< 0.01. ***P（P）< 0.001. 另见表S1-4。
图7
图7。Stathmin是MiR-9调节NPC迁移和增殖的重要靶点
（A） 和（D）搅乱的LNA和对照siRNA转染的神经球。（B） 和（E）抗miR-9 LNA和对照siRNA转染的神经球。（C） 和（F）抗miR-9 LNA和stathmin siRNA转染的神经球。在面板A-C中，使用来自hESCs的神经球，在转染后4天和嵌入3D Matrigel后1天获得图像。在D–F面板中，使用了来自大鼠NPC的神经球；转染6天后获得图像，并在塑料基质上培养神经球。在面板A-F中，比例尺为100μm。（G） 从神经圈迁移的最远端hNPC的细胞核之间的平均距离。数值为平均值±标准误差。n个>40个神经球。插入面板K也适用于面板G–J。（H） 迁移出神经球的大鼠NPC数量。数值为平均值±标准误差。n个>40个神经球。（一） 从神经圈到最远端迁移大鼠鼻咽癌细胞核的平均距离。数值为平均值±标准偏差n>40个神经球。（J） 在WST-1分析中，siRNA对stathmin表达的部分抑制挽救了miR-9活性丧失对hNPC增殖的影响。（K） hNPC移出移植到MGE的神经球的最大距离。每个条件下的数值均为平均值±标准偏差n>15个神经球。实验重复一次，结果相似。在所有面板中*P（P）<0.05, **P（P）< 0.005. ***P（P）< 0.001. 另请参见图S7。
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参考文献

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