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.2010年6月15日；19(12):2468-86.
doi:10.1093/hmg/ddq129。 Epub 2010年4月1日。

人视网膜色素上皮转录组分析及分子标记

N V斯特伦尼科娃 1, 马米尼什基斯, J J Barb公司, F王, C支, Y谢尔盖夫, 陈女士, A O爱德华兹, D斯坦博利安, G阿贝卡西斯, A Swaroop公司, P J蒙森, S S米勒
附属公司

人视网膜色素上皮的转录组分析和分子标记

N V斯特伦尼科娃等。 人类分子遗传学. .

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是对感光细胞功能和生存至关重要的极化细胞层。独特的生理学以及与光感受器的关系使RPE成为人类视觉的关键决定因素。因此，我们对天然和培养的人类胎儿和成人RPE进行了全局表达谱分析，并通过将观察到的RPE基因谱与诺华表达数据库（SymAtlas：http://wombat.gnf.org/index.html)在78个组织中。根据严格的选择标准，在三种不同的制剂中至少有10倍的高表达，我们确定了154个RPE特征基因，这些基因在RPE和11个独立组织中的qRT-PCR分析中得到了验证。一些高表达的特征基因编码与视觉周期、黑色素生成和细胞粘附有关的蛋白质，基因本体分析使RPE特征基因能够分配给上皮通道和转运蛋白（ClCN4、BEST1、SLCA20）或基质重塑（TIMP3、COL8A2）。15个RPE特征基因与已知眼科疾病相关，另外25个被映射到疾病位点的区域。在最近完成的AMD全基因组关联（GWA）数据集中对RPE特征基因的评估表明，TIMP3、GRAMD3、PITPNA和CHRNA3特征基因可能在AMD发病机制中具有潜在作用，值得进一步研究。我们认为RPE特征基因是视网膜疾病和生理研究（例如黑色素生成中的多巴色素互变酶）的理想候选基因。RPE特征基因集应允许验证源自人类胚胎或诱导的多能干细胞的RPE样细胞，以用于以细胞为基础的视网膜退行性疾病治疗。

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数字

图1。
图1。
实验设计。四组天然细胞和原始RPE培养物用于微阵列分析（共30个样本）：（ii）成人天然RPE（AN）；（ii）自然胎儿RPE（FN）；（iii）第1代时胎儿RPE（FC）的原代培养物；（iv）ARPE-19（AC），转化细胞系。为了确定培养条件对FC和AC基因表达的影响，将RPE细胞培养在转座或烧瓶上。共使用12只人类供体眼睛收集成人和胎儿的自然RPE细胞（每例4只供体），并建立胎儿RPE原代培养物（4只供者）。
图2。
图2。
分层聚类(A类)，以及三个主要主成分[PC1、PC2、PC3]的双位(B类)和(C类)证明RPE样本经培养后分为两大组，而不管样本来源（成人或胎儿）。使用来自胎儿培养细胞、胎儿自然细胞、成人自然RPE和ARPE-19细胞的30个样本，对54 675个探针组进行了微阵列基因表达分析。主成分分析（将原始的30个数据向量旋转为一组新的30个向量，其主成分或PC不相关并按降序排列）用于降低数据的维数，并允许可视化和聚类。数据还显示，来自同一培养物或组织类别的所有RPE样本都归在一起，排除了潜在的错误分类。椭圆表示每种组织类型的50%置信水平。每个PC旁边的百分比值表示原始30中总变化量占每个主成分表示的54 675个数据矩阵的比例。因此，这三个主要成分代表了54 675个探针组（85）中30个样本总变异的大多数（54%=25.6+15.6+12.8）。与其他三组相比，成年本地RPE基因表达谱具有更大的异质性。受控培养条件下的表达谱预计比来自不同个体的天然组织的表达谱更均匀。四个成人本地RPE组织来自25岁年龄段的个体，而胎儿组织来自有限的胎龄范围（16-18周）。
图3。
图3。
(A类)与诺华解剖多样性数据集中相同基因的表达相比，鉴定自然胎儿、成人自然和胎儿培养RPE细胞中常见的RPE特征基因（A）。通过选择每个RPE组中相对表达（rEx）值为10或更大的基因，将其平均表达值与所有78个诺华组织（SymAtlas，http://wombat.gnf.org/index.html). (B类)维恩图显示了AN、FN和FC RPE制剂中rEx≥10的基因数量，以及与诺华小组相比，这些列表中常见的“特征”基因数量。(C类)通过EASE分析确定，GO生物过程官能团在RPE特征中的比例过高（EASE评分P（P）<0.005).
图4。
图4。
对154个RPE特异基因（171个探针组）的图谱进行聚类分析，这些基因是通过对成人自然RPE（AN）组织、自然胎儿组织（FN）、胎儿培养RPE（FC）和ARPE-19（AC）的微阵列分析确定的。(A类)基因簇（Cl 1–Cl 4）反映了四种RPE制剂中RPE特异基因的不同相对表达（rEx）模式。(B类)每个水平色带代表每个RPE制剂中单个基因的平均rEx，色带显示rEx数值。热图右侧的簇树状图将基因分组为（A）中所示的簇。(C类)Log–胎儿自然型（FN-rEx值的垂直轴0-600）和成人自然型（AN-rEx值的水平轴0-600，）RPE特征基因-rEx的对数图。与成年本地RPE相比，统一线以上的基因在胎儿本地的表达水平较高。
图5。
图5。
通过qRT-PCR测定RPE特征基因的层次聚类获得的聚类树状图。树状图表示四种RPE制剂（AN、，n个= 2; FN、，n个= 3; FC中，n个= 3; 和AC/ARPE-19，n个=2），以及由水平虚线分隔的14种其他组织和培养物组成的验证集。从图的底部开始，验证组织为：大脑、结肠、肠道、肾脏、肝脏、肺睾丸、气管、calu3、组织混合物、黑素细胞、人类胎儿视网膜、人类胎儿脉络膜和培养的人类脉络膜RPE。后三种组织与RPE相邻，因此可能含有RPE污染，因此不包括在折迭计算中。RPE特征基因水平绘制，组织垂直绘制。每个垂直色带对应于不同组织制剂中150个基因中的一个基因的表达值，相对于该基因的平均值。聚类分析清楚地分离出自然RPE、培养RPE和“其他组织”集群I包含一组常见的基因，其中大多数基因在RPE组织中的表达量比验证集中的对应基因高出三到四个数量级。集群II突出显示了与培养RPE相比，在本地高表达约100倍的基因（虚线框）。
图6。
图6。
(A类)fcRPE（FC1–FC3，n个=3）和ARPE-19（AC1）小区。与qRT-PCR数据类似，RPE模型之间的TYRP1水平没有差异。在ARPE-19培养物中，BEST1、CDH3、CHRNA3、RPE65蛋白水平显著下调。(B类)检测胎儿自然和培养RPE、ARPE-19、脉络膜、视网膜、内皮细胞（HUVEC）、平滑肌细胞（SMC）、成纤维细胞（FB）和循环单核细胞（MN）中RPE65、BEST1、SILV1、CHD3、CHRNA3、SERPIF1蛋白的水平。
图7。
图7。
预测值与观测值的分位数（Q-Q）图P（P）-AMD组和对照组在每个基因区域内的SNP分布值，每个基因的5′端和3′端每侧延伸100 kb。该数字是根据GWAS研究中的33096个SNPs得出的。图中的每个点代表一个SNP。X（X）-轴是预期的顺序P（P）-使用−log10刻度的值，以及年-轴是观察到的P（P）-使用类似比例的值。统计包R 2.8.0(网址：http://www.r-project.org/)用于生成绘图。
图8。
图8。
通过GWAS和RPE特征研究的交叉验证，获得了18种蛋白质的信号肽结构和蛋白质定位。所有呈现的肽都具有三重结构，由中心疏水区（H核，红色）、N末端亲水区（N区，绿色）和位于蛋白质旁边的C末端侧翼区（C区，蓝色）组成。预测会形成α螺旋的残基被划线。H核在大多数序列中是螺旋形的，由亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸残基组成。使用UniProt信息资源进行蛋白质定位(http://pir.georgetown.edu)并使用Promals3D程序对序列进行比对(http://prodata.swmed.edu/promals3d/promals2d.php).
图9。
图9。
使用慢病毒介导的shRNA转导在细胞培养插入物上生长的hfRPE培养物中的DCT沉默(A类)不同shRNA克隆转导后DCT蛋白印迹的半定量评价。标签表明不同的克隆：NT-非靶向结构和38-42是DCT靶向shRNA克隆。在定量带强度和归一化微管蛋白后，计算DCT蛋白表达shRNA转导的细胞相对于NT-shRNA转导细胞的表达（100%）。(B类)在转导DCT38 shRNA克隆的插入物上生长的融合hfRPE单层的跨上皮电阻测量，并与NT构建对照进行比较(P（P）< 0.05;n个= 6). (C类–H（H）)表达针对DCT（F、G和H）和NT控制shRNA（C、D和E）的shRNA的hfRPE细胞的代表性免疫组织化学染色。每个面板的下部是面对面通过z（z）-轴。每个面板的顶部是通过z（z）-平面。DAPI信号的最低部分（白点线）描绘基底膜。白色箭头指向hfRPE顶面。红色：DCT（C，F）、ezrin（D，G）、actin（E，H）。蓝色：DAPI染色细胞核；绿色：ZO-1表示分离顶膜和基底外侧膜的紧密连接位置。用DCT38 shRNA转染hfRPE细胞可显著降低细胞内DCT水平（F），降低和破坏ZO-1定位（F和G），并破坏F-actin纤维，使其变得更加弥散，并伴有顶端定位（H）。
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