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.2010年7月；139（1）:323-34.e7。
doi:10.1053/j.gastro.2010.03.052。 Epub 2010年3月27日。

Toll样受体9通过诱导白细胞介素-1β促进小鼠脂肪性肝炎

三浦口一 1, Yuzo Kodama公司, 井口早矢香, 伯恩德·施纳布尔, 青山东彦（Tomonori Aoyama）, Hirohide Ohnishi公司, 杰罗尔德·M·奥列夫斯基, 大卫·A·布伦纳, Ekihiro Seki先生
附属公司

Toll样受体9通过诱导小鼠白细胞介素-β促进脂肪性肝炎

三浦口一等人。 胃肠病学. 2010年7月.

摘要

背景和目标：非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的发展涉及先天免疫系统，并由库普弗细胞和肝星状细胞（HSC）介导。Toll样受体9（TLR9）是一种模式识别受体，可识别细菌衍生的磷酸胞嘧啶鸟嘌呤（CpG）DNA，并激活先天免疫。我们研究了TLR9信号和炎症细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）在脂肪性肝炎、纤维化和胰岛素抵抗中的作用。

方法：野生型（WT）、TLR9（-/-）、IL-1受体（IL-1R）（-/-/）和MyD88（-/--）小鼠喂食胆碱缺乏氨基酸定义（CDAA）饮食22周，然后评估脂肪性肝炎、纤维化和胰岛素抵抗。在分离的肝细胞中评估脂质积聚和细胞死亡。分离Kupffer细胞和HSC，分别评估炎症反应和纤维生成反应。

结果：CDAA饮食在WT小鼠中诱导NASH，其特征是脂肪变性、炎症、纤维化和胰岛素抵抗。与WT小鼠相比，TLR9（-/-）小鼠显示出较少的脂肪性肝炎和肝纤维化。在炎症细胞因子中，TLR9（-/-）小鼠IL-1β的产生受到抑制。库普弗细胞对CpG寡核苷酸产生IL-1β。IL-1β而非CpG-寡核苷酸增加了肝细胞中的脂质积聚。肝细胞中的脂质积聚导致核因子-κB失活，导致细胞对IL-1β的反应性死亡。IL-1β诱导HSC的成纤维反应，包括分泌金属蛋白酶组织抑制剂-1。与WT小鼠相比，IL-1R（-/-）小鼠减少了脂肪性肝炎和纤维化。MyD88是TLR9和IL-1R信号转导的衔接分子，缺乏MyD88的小鼠也可以减少脂肪性肝炎和纤维化。与CDAA饮食的WT小鼠相比，TLR9（-/-）、IL-1R（-/-/）和MyD88（-/--）小鼠的胰岛素抵抗更低。

结论：在NASH小鼠模型中，TLR9信号诱导Kupffer细胞产生IL-1β，导致脂肪变性、炎症和纤维化。

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利益冲突

作者没有透露任何冲突。

数字

图1
图1
TLR9缺乏可减轻脂肪性肝炎。WT和TLR9−/−小鼠喂食CSAA（CS；n=4）或CDAA（CD；n=8）饮食22周。封闭式酒吧、WT小鼠；露天酒吧，TLR9−/−老鼠。(A类)肝脏切片用H&E染色(箭头炎症细胞；箭头，膨胀的肝细胞），油红O，TUNEL(箭头; 凋亡细胞）和天狼星红。原始放大倍数×200用于H&E和TUNEL染色，×100用于Oil-red O和天狼星红染色。(B类)TUNEL阳性细胞的数量(C类)天狼星红-阳性区域和(D类)计算NAFLD活动评分。未检测到N.D。(E类)测定肝甘油三酯和血清ALT水平。(F类)通过实时定量PCR测定肝纤维化标记物的mRNA水平。数据表示平均值±SD*P（P）< .05; 不重要。
图2
图2
TLR9诱导IL-1βKupffer细胞的生产。(A类和B类)肝脏和血清取自22周龄的CSAA（CS）或CDAA（CD）饮食喂养的WT、TLR9−/−和MyD88−/−老鼠。(A类)采用实时定量PCR（qPCR）检测肝脏炎症细胞因子mRNA水平。(B类)血清IL-1β用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其含量。(C类)给喂食CDAA饮食的WT小鼠（21周龄）注射对照组（Veh；n=6）或氯膦酸脂质体（Clo；n=5），以耗尽Kupffer细胞。脂质体注射后1周取肝脏和血清。肝脏IL-1 mRNA和血清蛋白水平β分别用qPCR和ELISA检测。(D类)白介素-1βqPCR检测肝细胞、Kupffer细胞、HSC和窦状内皮细胞的mRNA表达。(E类)重量，TLR9−/−和MyD88−/−Kupffer细胞用5μg/mL CpG-ODN或非CpG-ODN，然后是IL-1β用qPCR检测mRNA水平。转换活性IL-1β来自proIL-1β，Kupffer细胞与5μg/mL CpG-ODN（n=4，每组），然后分泌IL-1β用酶联免疫吸附法测定其含量。数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不重要。
图3
图3
白介素-1β促进肝细胞的脂质代谢和细胞死亡。(A–C)重量，TLR9−/−和IL-1R−/−用10 ng/mL IL-1处理肝细胞β。车辆，车辆。(A类)脂质积聚（油红O染色）和(B类)在WT、TLR9中测量甘油三酯含量（归一化为蛋白质浓度）−/−和IL-1R−/−IL-1处理的肝细胞β24小时。(C类)用IL-1处理肝细胞β持续8小时。用实时定量PCR（qPCR）检测肝细胞中DGAT的mRNA表达。(D–F型)从喂食CSAA（CS）或CDAA（CD）饮食的22周龄小鼠中分离肝细胞。(D类)用IL-1处理肝细胞β持续24小时。分别用Hoechst33342和碘化丙啶测定细胞凋亡和坏死。(E类)测定上清液中的ALT和LDH水平。(F、 左)mRNA水平Bcl2公司和Bax公司通过qPCR检测。(F、 右)NF公司-κB活性对IL-1的反应β由NF检查-κB–报告人分析。数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不另作说明，不重要。原始放大倍数，×400(A类)，×200（C）。
图4
图4
库普弗细胞衍生IL-1β促进HSC激活。(A–D)与WT、TLR9隔离的HSC−/−和IL-1R−/−用10 ng/mL IL-1刺激小鼠β持续8小时以测量TIMP1的mRNA表达(A类)，PAI-1(B类)、胶原蛋白(C类)和斑比(D类)通过定量实时PCR（qPCR），并用Western blot检测24小时上清液中TIMP1的表达(A类). (E类)通过用5μg/mL CpG-ODN或非CpG-ODN 24小时。然后，WT，TLR9−/−和IL-1R−/−用Kup-CM处理HSC 8小时，通过qPCR测定纤维生成标记物的mRNA表达(E、 左)并持续24小时以测定上清液中TIMP1蛋白的表达(E、 右). 数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不重要。
图5
图5
白细胞介素-1R−/−小鼠脂肪变性和纤维化减弱。WT和IL-1R−/−给小鼠喂食CSAA饮食（CS；n=4）或CDAA饮食（CD；n=8）22周。封闭式酒吧、WT小鼠；露天酒吧，IL-1R−/−老鼠。(A类)健康与环境(箭头，炎症细胞；箭头，膨胀的肝细胞），油红O，TUNEL(箭头; 凋亡细胞），并进行天狼星红染色。原始放大倍率，H&E和TUNEL为×200，油红O和天狼星红为×100(B类)TUNEL阳性细胞数量和(C类)天狼星红阳性区域在IL-1R中受到抑制−/−老鼠。(D类)IL-1R抑制NAFLD活性评分、脂肪变性和纤维化−/−老鼠。未检测到N.D。(E类)IL-1R中肝甘油三酯和血清ALT水平降低−/−老鼠。(F类)通过实时定量PCR检测肝纤维化标记物的mRNA水平。数据表示平均值±SD*P（P）< .05; 不重要。
图6
图6
MyD88基因缺失可改善脂肪性肝炎。WT和MyD88−/−给小鼠喂食CSAA（CS，n=4）或CDAA（WT-CD，n=8；MyD88−/−-CD，n=7）饮食22周。封闭式酒吧、WT小鼠；露天酒吧，MyD88型−/−老鼠。(A类)健康与环境(箭头，炎症细胞；箭头，膨胀的肝细胞），油红O，TUNEL(箭头; 凋亡细胞），天狼星红染色显示MyD88的脂肪变性、炎症细胞、凋亡和纤维化减少−/−老鼠。原始放大倍数，H&E和TUNEL染色×200，Oil-Red O和Sirius红色染色×100。(B类)TUNEL阳性细胞(C类)天狼星红-阳性区域，以及(D类)MyD88中NAFLD活动评分受到抑制−/−老鼠。未检测到N.D。(E类)MyD88抑制了肝甘油三酯和血清ALT水平−/−老鼠。(F类)通过实时定量PCR测定肝纤维化标记物的mRNA水平。数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不重要。
图7
图7
(A类)TLR9–MyD88–IL-1R轴促进胰岛素抵抗。将正常的周粮（N）、CSAA（CS）和CDAA（CD）饲喂至WT、TLR9−/−，IL-1R−/−和MyD88−/−小鼠22周（每组6只）。胰岛素抵抗用HOMA-IR检测。数据表示平均值±SEM**P（P）< .01; 不另作说明，不重要。(B类)通过TLR9和IL-1促进NASH发展的拟议机制βTLR9配体，包括细菌DNA或其他内源性介质，刺激Kupffer细胞产生IL-1β分泌IL-1β作用于肝细胞，增加脂质积累和细胞死亡，导致脂肪变性和炎症。白介素-1β还刺激HSC产生纤维化因子，如胶原蛋白和TIMP-1，从而导致纤维化。同时，TLR9-MyD88轴促进胰岛素抵抗。如前所述，TLR4也有助于NASH中的该网络。
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