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.2010年7月；139（1）：259-69.e3。
doi:10.1053/j.gastro.2010.03.045。 Epub 2010年3月27日。

缺氧诱导因子信号传导在艰难梭菌诱导的肠道损伤中提供保护

西蒙·阿赫罗塔 1, 凯拉罚款, 杰弗里·吴, 丹亚·特拉布西, 乔什·李, 岩原英吉, 阎丽, 威廉·G·威尔莫, 郑硕允, 梅兰妮·斯库利, 托马斯·路易, 肖恩·梅德利科特, 马尼甘丹·勒琼, 克里斯·查迪, 格伦·阿姆斯特朗, 肖恩·科尔根, 丹尼尔·A·穆鲁, 贾斯汀·麦克唐纳, 保罗·L·贝克
附属公司

低氧诱导因子信号通路对艰难梭菌引起的肠道损伤提供保护

西蒙·阿赫罗塔等。 胃肠病学. 2010年7月.

摘要

背景和目标：艰难梭菌是医院感染性腹泻的主要原因。抗生素耐药性和菌株毒力的增加增加了全世界与艰难梭菌相关的死亡人数。宿主对艰难梭菌的固有反应机制尚未解决；我们认为缺氧诱导因子（HIF-1）在艰难梭菌性结肠炎中具有先天性保护作用。我们研究了艰难梭菌毒素对HIF-1调节的影响，并评估了HIF-1α在艰难梭菌介导的损伤/炎症中的作用。

方法：我们评估了暴露于艰难梭菌毒素后人类粘膜活检样本和Caco-2细胞中HIF-1αmRNA和蛋白水平以及DNA结合。我们使用艰难梭菌毒素诱导的肠道损伤的小鼠回肠环模型。用肠上皮中HIF-1α靶向缺失的小鼠评估HIF-1 alpha信号对艰难梭菌毒素的反应。

结果：粘膜活检标本和暴露于艰难梭菌毒素的Caco-2细胞HIF-1α转录和蛋白水平显著增加。在Caco-2细胞中也观察到毒素诱导的DNA结合。一氧化氮合酶抑制剂减弱了毒素诱导的HIF-1α积累。体内肠上皮HIF-1α的缺失导致更严重的毒物诱导的肠道损伤和炎症。相反，用二甲基草酰甘氨酸稳定HIF-1α可以减轻毒素诱导的损伤和炎症。这与HIF-1调节的保护因子（如血管内皮生长因子-α、CD73和肠三叶因子）的诱导以及促炎分子（如肿瘤坏死因子和Cxcl1）的下调有关。

结论：HIF-1α保护肠黏膜免受艰难梭菌毒素的侵害。HIF-1α对艰难梭菌毒素的固有保护作用被开发为治疗艰难梭菌相关疾病的药物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露：不存在利益冲突

数字

图1
图1
艰难梭菌结肠炎与HIF-1α表达增加有关。（a）使用小鼠抗HIF-1α单克隆抗体（NB100-105）对组织切片进行HIF-1蛋白染色。HIF-1α在患者结肠组织中的免疫定位（手术切除）：(i–ii)，在结肠癌筛查或结肠癌正常切除边缘活检的正常人结肠组织中没有HIF-1α染色；(iii–vi)，结肠组织中HIF-1α染色强烈艰难梭菌-相关病理学。炎症细胞、上皮细胞、内皮细胞以及粘膜肌层（箭头之间）的平滑肌细胞、内膜血管和肌层中的粘膜、粘膜下层和肌层进行了离散染色。标准免疫组织化学对照（例如省略小鼠抗HIF-1α抗体）为阴性。（b）暴露于艰难梭菌毒素（50µg/mL；3h）。从健康人身上采集两次活检（并排进行），并立即用毒素或溶媒溶液（与无菌BHI培养基体积相匹配）培养。所有值均为平均值±S.E.M.，（n=14）。*表示p<0.05。
图2
图2
Caco-2细胞在正常氧条件下经HIF-1αmRNA和蛋白水平升高艰难梭菌毒素。（a）Caco-2细胞暴露于毒素（0.1µg/mL）或CoCl2（100µM）持续1小时、2小时和4小时。将PBS/BHI添加到细胞中作为对照。分离总RNA，通过半定量RT-PCR测定HIF-1α和β2-微球蛋白（β2-MG；内部对照）的表达。（b）Caco-2细胞暴露4h，浓度增加艰难梭菌qPCR评估毒素增加HIF-1α基因表达；*表示与0µg/mL相比p<0.05，#表示与0.1和0µg/mL相比p<0.05，n=5。（c）HIF-1α蛋白在Caco-2细胞中表达增加艰难梭菌毒素（100µg/mL）或氯化钴2（100µM）。通过western blotting（NB100-105）分析核提取物（50µg总蛋白）的HIF-1α蛋白水平。所有值（平均值±S.E.M.，n=4）*p<0.05。抑制NO合成酶可减弱毒素诱导的HIF-1α蛋白增加。用100µM L-NAME预处理Caco-2细胞（d）或1400W（e）暴露毒素前30分钟（100µg/mL；12小时）。通过western blotting（NB100-105）评估细胞溶胶提取物。所有值均为平均值±S。E.M.，（n=4）*与对照组相比p<0.05**与毒素处理细胞相比，p<0.05。
图3
图3
艰难梭菌毒素暴露促进Caco-2细胞中HIF-1依赖性启动子结合活性和转录活性。（a）通过电泳迁移率变化分析（EMSA）评估HIF-1α与EPO低氧反应元件（HRE）的DNA结合。核提取物是从暴露于艰难梭菌毒素（100µg/mL）或氯化钴2（100µM）。在某些情况下，在DNA结合反应中添加抗HIF-1α单克隆抗体会产生EMSA“超转移”。（b）通过荧光素酶报告检测，毒素暴露促进Caco-2细胞中HIF-1α转录活性。Caco-2细胞与萤火虫荧光素酶报告子和Renilla荧光素酶控制质粒瞬时共转染。细胞在10µg/mL的常氧条件下培养4、18或24小时艰难梭菌毒素或100µM CoCl2通过将萤火虫荧光素酶活性归一化为雷尼拉荧光素酶活性来校正转染效率。用空pGL3载体转染对照细胞，并用艰难梭菌毒素或氯化钴2.所有值（平均值±S.E.M.，n=4）均表示为相对于任意定义为1的对照组的折叠诱导。（c–d）HIF-1α缺陷的Caco-2细胞更容易受到艰难梭菌毒素引起的损伤。（c）稳定转染HIF-1αsiRNA（Caco-2 HIF-1 a-艰难梭菌毒素或氯化钴2.（d）Caco-2 HIF-1α−/−细胞对艰难梭菌毒素，通过与毒素（60µg/mL）孵育2小时后的经上皮阻力（TER）进行评估。所有数值均为平均值±S.E.M.，（n=4），*表示p<0.05。
图4
图4
纯化的TcdA和TcdB增加HIF-1α蛋白和DNA结合。（a）将Caco-2细胞暴露于纯化的TcdA（100ng/mL，500ng/mL）和TcdB（10ng/mL，100ng/mL）中4h。Western blot是四个实验的代表（ab6489）。（b）CoCl作用下Caco-2细胞中HIF-1α与EPO HRE的DNA结合2（100µM）或纯化的TcdA（100ng/mL）和TcdB（100ng/mL）。
图5
图5
艰难梭菌毒素增加HIF-1α的表达，并诱导炎症体内CDAD模型。（a）用qPCR测定对照动物（无手术）、经溶媒处理或暴露于100µg艰难梭菌回肠环中的毒素（与对照组和载体相比，p<0.05，n=5）。（b）HIF-1α蛋白在用载体或艰难梭菌毒素（100µg），*与载体相比p<0.05，n=4（NB100-105）。（c）在对照动物（无手术）和用载体或艰难梭菌毒素（100µg），与对照组和载体相比，*p<0.05，与载体相比，**p<0.05，n=9。（d）用溶媒或艰难梭菌毒素（100µg），*与溶媒相比p<0.05，n=9。（e）对从载体和毒素处理的回肠环中分离的RNA进行qPCR。数据表示为相对于控件的折叠式变化，其中1等于控制组中的表达式（虚线）*与对照组相比p＜0.05，n＝3。
图6
图6
肠上皮HIF-1α靶向缺失增强艰难梭菌毒物引起的炎症。（a）用MPO水平评估从野生型I29和HIF-1α上皮靶向敲除小鼠（HIF-1β−/−）中分离的回肠中的组织炎症艰难梭菌毒素（100µg），*与野生型I29相比p<0.05，n=6。（b）对野生型I29和HIF-1α上皮靶向敲除小鼠（HIF-1艰难梭菌毒素（100µg），*p与野生型I29相比<0.05，n=6。（c）HIF-1α−/−（顶行）和野生型I29（底行）暴露4h后的H&E染色回肠切片艰难梭菌毒素（100微克）。
图7
图7
用二甲基草酰甘氨酸（DMOG，手术前2天每天8毫克）预处理的动物表现明显减少艰难梭菌毒素引起的组织损伤。（a）用溶媒处理的小鼠回肠H&E染色的代表性切片（i和ii）,艰难梭菌毒素（iii和iv）和DMOG预处理，然后艰难梭菌毒素暴露（v&vi）.（b）用载体（无菌PBS、黑条）处理的小鼠回肠切片的组织学分析，艰难梭菌毒素（100µg，灰条）或DMOG艰难梭菌毒素（白条）：拱门。Sc.——建筑分数；燃烧。Sc.——炎症评分；墓志铭。大坝。–上皮损伤；中微子。Sc.–中性粒细胞评分，与培养基相比*p<0.05#与相比p<0.05艰难梭菌毒素；n=8-12。
图8
图8
用二甲基草酰甘氨酸（DMOG，手术前2天每天8毫克）治疗的小鼠HIF-1α水平增加（a）与注射PBS载体的小鼠相比，从全层回肠段分离的蛋白质提取物中（b）用MPO水平评估肠道炎症。对照组表示在未接受手术的动物中测得的水平，*p与对照组和载体相比<0.05**与相比p<0.05艰难梭菌毒素治疗，n=6-8。之前用DMOG进行预处理艰难梭菌毒素暴露与肠屏障功能和保护相关因素的升高有关（c）炎症介质水平降低（d）如用qPCR测量的。数据是折叠式的艰难梭菌毒素治疗，其中1等于毒素组的表达*与毒素相比，p<0.05，n=3。（e）DMOG治疗可防止艰难梭菌毒素诱导的上皮屏障功能破坏。Caco-2细胞暴露于载体（对照），艰难梭菌毒素（60µg/mL）、DMOG（500µM）和艰难梭菌毒素（60µg/mL）或DMOG（500µM）单独使用。时间（以分钟为单位）表示向单层添加毒素后经过的时间，数据以对照TER的百分比表示，*与对照和毒素相比p<0.05**与毒素相比p<0.005#与对照组相比，p<0.005，n=4。
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