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。2010年4月；120(4):1056-68.
doi:10.1172/JCI41563。 Epub 2010年3月24日。

Sirt1激活保护小鼠肾髓质免受氧化损伤

何文娟 1, 王莹莹, 张明志, 李友, 琳达·S·戴维斯, 洪帆, 海春阳, 艾格妮斯·福戈（Agnes B Fogo）, 罗伊·泽特, Raymond C Harris公司, 马修·D·布雷耶, 川明浩
附属公司

Sirt1激活保护小鼠肾髓质免受氧化损伤

何文娟等。 临床研究杂志。 2010年4月。

摘要

Sirtuin 1（Sirt1）是一种NAD+依赖性脱乙酰酶，发挥氧化代谢的许多多效性作用。由于局部缺氧和高渗，肾髓质受到极度氧化应激。在这里，我们开始研究Sirt1在肾脏中的作用。我们的初步分析表明，它在小鼠肾髓质间质细胞中大量表达。敲低原代小鼠肾髓质间质细胞中Sirt1的表达大大降低了细胞对氧化应激的抵抗力，而使用白藜芦醇或SRT2183的药物Sirt1激活可提高细胞对氧化胁迫的存活率。单侧输尿管梗阻（UUO）肾损伤模型在Sirt1+/-小鼠中诱导的肾细胞凋亡和纤维化明显多于野生型对照组，而药物Sirt1激活显著减弱野生型小鼠的细胞凋亡和肝纤维化。此外，Sirt1缺乏可减弱培养的小鼠肾髓质间质细胞中氧化应激诱导的COX2表达，Sirt1+/-小鼠体内显示UUO诱导的COX2表达降低。相反，Sirt1激活增加了肾髓质间质细胞COX2在体内外的表达。此外，外源性PGE2显著降低氧化应激后Sirt1缺陷肾髓质间质细胞的凋亡。总之，这些结果确定Sirt1是氧化应激后小鼠肾髓质间质细胞的重要保护因子，并表明Sirt1的保护功能部分归因于其对COX2诱导的调节。因此，我们认为Sirt1提供了一个潜在的治疗靶点，可以最大限度地减少氧化应激后肾髓质细胞的损伤。

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数字

图1
图1。Sirt1在小鼠肾脏中的表达。
(A类)免疫印迹法检测Sirt1蛋白在C57BL/6J小鼠肾髓质（包括外髓质和内髓质）和肾皮质区的表达。每个通道代表一只老鼠的裂解物。(B类)Sirt1（信号1）用qRT-PCR检测肾髓质和皮质的mRNA表达(n个= 4, *P（P）< 0.05). (C类)小鼠肾脏Sirt1表达的免疫组织化学。(D类)Sirt1（红色）和肾段标记物（绿色）的免疫荧光共染：AQP1（近端小管）、THP（厚升支）、AQP2（集合管）。G、 肾小球。(E类)COX2启动子驱动EGFP报告转基因小鼠EGFP阳性RMIC中的Sirt1（红色）免疫荧光染色。
图2
图2。小鼠肾脏中的氧化应激标记物。
使用氧化应激标记物抗亚硝基酪氨酸抗体（左面板）和抗4-羟基壬醛抗体（右面板）的免疫组织化学。底部的面板显示肾内髓质的高倍图像。
图3
图3。Sirt1保护培养的RMIC免受氧化应激。
(A类和B类)用携带Sirt1选择性shRNA或对照病毒的慢病毒感染原代小鼠RMIC。免疫印迹法检测Sirt1、Sirt2和Sirt3的表达(A类、密度测定法，n个= 4, *P（P）<0.0001）和RT-PCR(B类). (C类和D类)对照组或Sirt1 shRNA处理的RMIC用或不用Sirt1激活剂白藜芦醇（5μM）进行预处理，并用H2哦2（250μM）持续12小时。用结晶紫染色法检测细胞活力(n个= 6, *P（P）<0.0001与对照病毒处理的H细胞相比2哦2;†P（P）<0.001与对照病毒处理的H细胞相比2哦2不含白藜芦醇）。(E类和F类)对照组或Sirt1 shRNA处理的RMIC用或不用Sirt1激活物SRT2183（5μM）进行预处理，并用H2哦2（500μM）持续6小时。TUNEL法检测细胞凋亡(n个=15*P（P）<0.05，与对照病毒处理的细胞相比2哦2;†P（P）<0.001与H细胞相比2哦2无SRT2183）。(G公司和小时)对照组或Sirt1 shRNA处理的RMIC用或不用Sirt1激活物SRT2183（5μM）进行预处理，并用H2哦2（500μM）持续6小时。用免疫印迹法检测细胞凋亡标志物裂解caspase-3的表达(n个=4，密度测定*P（P）<0.001与对照病毒处理的H细胞相比2哦2;†P（P）<0.05，与H细胞相比2哦2无SRT2183）。
图4
图4。杂合Sirt1基因敲除小鼠肾脏中Sirt1表达降低。
(A类)相对Sirt1（信号1）野生型全肾mRNA表达水平(Sirt1（信号1）+/+)小鼠和杂合Sirt1基因敲除(Sirt1（信号1）+/——)用qRT-PCR检测小鼠(n个= 4, *P（P）< 0.01). (B类)全肾Sirt1蛋白表达水平Sirt1（信号1）+/+和Sirt1（信号1）+/–用免疫印迹法检测小鼠(n个=6，密度测定*P（P）< 0.05). (C类)Sirt1在大鼠整个肾脏中的表达Sirt1（信号1）+/+和Sirt1（信号1）+/–UUO后3天用免疫印迹法检测小鼠(n个=4，密度测定；†P（P）<0.0001与对侧肾脏Sirt1（信号1）+/+老鼠；‡P（P）<0.0001与对侧肾脏Sirt1（信号1）+/–小鼠*P（P）<0.001与肾梗阻Sirt1（信号1）+/+老鼠）。
图5
图5。Sirt1缺乏与输尿管梗阻肾细胞凋亡和纤维化增加有关。
(A类)代表性图片（原始放大倍数，×200）和肾髓质TUNEL阳性细胞凋亡的定量Sirt1（信号1）+/+小鼠和Sirt1（信号1）+/–UUO后3天的小鼠(*P（P）< 0.05). (B类)免疫印迹法检测凋亡标记裂解caspase-3在大鼠全肾的表达Sirt1（信号1）+/+和Sirt1（信号1）+/–UUO后3天的小鼠(n个=4，密度测定*P（P）<0.01与Sirt1（信号1）+/+老鼠）。(C类)肾脏切片上的代表性图片（原始放大倍数，×200）和天狼星红染色定量Sirt1（信号1）+/+和Sirt1（信号1）+/–UUO后7天的小鼠(*P（P）<0.05与肾梗阻Sirt1（信号1）+/+老鼠）。(D类)全肾Col1蛋白表达水平Sirt1（信号1）+/+和Sirt1（信号1）+/–UUO后7天用免疫印迹法检测小鼠(n个=5，密度测定*P（P）<0.05与肾梗阻Sirt1（信号1）+/+老鼠）。
图6
图6。Sirt1激活与输尿管梗阻肾脏的凋亡和纤维化减少相关。
(A类)UUO后3天，经车辆治疗或Sirt1激活剂SRT1720治疗（100 mg/kg/d）的野生型小鼠肾髓质中TUNEL阳性凋亡的代表性图像（原始放大倍数，×200）和量化(*P（P）< 0.05). (B类)UUO后3天，免疫印迹法检测车辆治疗或SRT1720治疗野生型小鼠整个肾脏中裂解caspase-3的表达(n个=4，密度测定*P（P）<0.0001与车辆治疗小鼠的肾脏阻塞相比）。(C类)UUO后7天，车辆治疗或SRT1720治疗小鼠肾脏切片上的代表性图像（原始放大倍数，×200）和天狼星红染色定量(*P（P）与车用治疗小鼠的肾脏阻塞相比，<0.05）。(D类)通过免疫印迹法评估UUO后7天，车辆治疗或SRT1720治疗野生型小鼠的整个肾脏中Col1蛋白的表达水平(n个=5，密度测定*P（P）与车用治疗小鼠的肾脏阻塞相比，<0.05）。五、 车辆；SRT、SRT1720。
图7
图7。Sirt1调节培养的RMIC中COX2的表达。
(A类)野生型或Sirt1敲除培养的RMIC受到H的攻击2哦2（500μM）持续0、3或6小时。通过免疫印迹检测Sirt1、COX2和COX1的表达。(B类)野生型或Sirt1敲除型RMIC受到H的挑战2哦2（500μM）持续0或6小时。COX2型通过qRT-PCR评估mRNA表达(n个= 4, *P（P）<0.0001与H的野生型细胞相比2哦2). (C类)用Sirt1激活剂SRT2183（0、5、10、20μM）处理RMIC 8小时，并用免疫印迹法检测COX2的表达(n个= 4). (D类)在带有H的野生型或Sirt1敲除型RMIC中测量COX2荧光素酶报告活性2哦2使用双荧光素酶检测试剂盒（250μM）0或12小时(n个= 12, *P（P）<0.0001与H的野生型细胞相比2哦2). (E类)对未处理或H进行ChIP测定2哦2-使用抗Sirt1抗体和PCR引物处理（500μM，3小时）RMIC，识别转录起始位点上游的小鼠COX2 5′序列[-712，-396]或[-4166，-3946]。C、 对照组：用正常兔IgG免疫沉淀。数据代表了3个独立实验。
图8
图8。Sirt1调节体内RMIC中COX2的表达。
(A类)典型的免疫荧光图像显示UUO后3天野生型小鼠梗阻肾髓质中COX2诱导（红色）。Costaining进一步显示AQP2阳性（绿色）收集管（右侧面板）之间的RMIC中诱导的COX2（红色）。(B类)免疫印迹法检测COX2在大鼠全肾中的表达Sirt1（信号1）+/+和Sirt1（信号1）+/–UUO后3天的小鼠(n个=5，密度测定*P（P）<0.05与肾梗阻Sirt1（信号1）+/+老鼠）。(C类)野生型小鼠用载体或Sirt1激活剂SRT1720（100 mg/kg/d）治疗5天。免疫荧光协同染色显示，SRT1720诱导AQP2阳性（绿色）集合管间RMIC中COX2表达（红色）。(D类)用免疫印迹法检测载体或SRT1720处理小鼠的整个肾脏中COX2的表达(n个=4，密度测定*P（P）<0.05，与车辆处理小鼠相比）。
图9
图9。COX2活性及其衍生PGE2保护培养的RMIC免受氧化应激。
(A类和B类)用COX2选择性抑制剂SC58236（0.5μM，2.5μM）或PGE预处理野生型或Sirt1敲除培养的RMIC2（100 nM，1μM），并用H激发2哦2（250μM）培养12小时。用结晶紫染色法检测细胞活力(n个= 6; *P（P）<0.0001与H细胞相比2哦2独自一人；†P（P）<0.0001与带有H的Sirt1敲除细胞相比2哦2不带PGE2;‡P（P）<0.05与带有H的Sirt1敲除细胞相比2哦2和100 nM PGE2). (C类和D类)用SC58236（2.5μM）或PGE预处理野生型或Sirt1敲除型RMIC2（100 nM）和H挑战2哦2（500μM）培养6小时。TUNEL法检测细胞凋亡(n个= 15; *P（P）<0.001与H细胞相比2哦2独自一人；†P（P）<0.05与带有H的Sirt1敲除细胞相比2哦2不带PGE2). (E类)用100 nM PGE预处理野生型或Sirt1敲除型RMIC2和H的挑战2哦2（500μM）持续6小时。免疫印迹法检测细胞凋亡标记裂解caspase-3的表达(n个=4，密度测定*P（P）<0.05与带有H的Sirt1敲除细胞相比2哦2无PGE2）。
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中的注释

  • 临床投资杂志。120:1026.

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