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.2010年4月；120(4):1140-50.
doi:10.1172/JCI41329。 Epub 2010年3月15日。

长期使用膜封闭剂预防营养不良犬的严重心脏损伤和心室扩张

德韦恩·汤森 1, 伊曼纽尔·特纳, 安田宗一郎, 约书亚·马丁代尔, 詹妮弗·戴维斯, 迈克尔·希林福德, 乔·科尔内盖, 约瑟夫·梅茨格
附属公司

长期使用膜封闭剂预防营养不良犬的严重心脏损伤和心室扩张

德韦恩·汤森等。 临床研究杂志. 2010年4月.

摘要

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种由细胞骨架蛋白dystrophin缺乏引起的横纹肌退化的致命疾病。肌营养不良蛋白缺乏会导致肌膜不稳定、骨骼肌萎缩、心肌病和心力衰竭。姑息性呼吸护理的进展增加了杜氏肌营养不良患者心脏病的发病率，目前尚无治愈或有效的治疗方法。在这里，我们已经证明，向严重受损的营养不良犬慢性输注封膜泊洛沙姆可以减少心肌纤维化，阻断血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）和脑型利钠肽（BNP）的升高，并完全防止左心室重构。从机制上讲，我们观察到营养不良犬心肌细胞的细胞顺应性降低的原发性缺陷明显大于轻度受累的mdx小鼠心肌细胞，这与营养不良犬的心肌细胞缺乏营养素上调有关。有趣的是，在慢性泊洛沙姆治疗后，分离的犬心肌细胞的顺应性仍然很差，但直接应用泊洛沙默后可以恢复正常。总之，这些发现表明肌营养不良蛋白和utrophin对膜稳定性依赖性心肌细胞的机械顺应性至关重要，泊洛沙姆在肌营养不良素/utrophin缺乏症中提供了一种高效的膜稳定化学替代物。我们认为膜封闭剂治疗是DMD心脏病和其他可能由膜缺陷引起的疾病的潜在治疗方式。

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数字

图1
图1。GRMD犬成年心肌细胞的力学特性。
通过酶消化法从2只未经治疗的1岁GRMD犬的心脏中分离出膜完整的成年心肌细胞。(一)将微碳纤维附着在分离的心肌细胞上，以便进行机械操作和张力测量（照片）。膜完整心肌细胞的被动张力描记延伸至如下所示的肌节长度。mN，毫牛顿。(B类)总结显示了从野生型和GRMD犬和中密度纤维板老鼠。(C类)肌细胞耐受的最大肌节长度总结*P（P）< 0.05. (D类)通过洗涤剂溶解膜，可以直接评估肌丝。在标称钙的溶液中，野生型和GRMD心肌细胞的肌丝被动延伸没有显示出差异（每个基因型的2只狗的7-8个细胞）。(E类)对膜溶解心肌细胞中肌丝钙敏感性的评估表明，GRMD和野生型心肌细胞之间没有差异。数据来自2-3只动物分离的5-7个心肌细胞。pCa，–对数[Ca2+].
图2
图2。GRMD动物麻醉诱导后血清cTnI升高。
全麻诱导后几分钟内采集的血清样本显示心脏损伤生物标志物显著升高(一). (B类)GRMD犬血清CK显著升高。数值显示为平均值±SEM；n个= 8–10.‡P（P）<0.05 byt吨测试。
图3
图3。GRMD动物的基线血流动力学功能。
(一和B类)野生型下腔静脉阻塞时典型的左室压力描记(一)和GRMD(B类)红心。(C类和D类)舒张末期容积总结(C类)和冲程容积(D类)休息时（黑条）和多巴酚丁胺反应时（白条）。平均舒张末期容积（EDV）变化总结(E类)和收缩末期容积（ESV）(F类)多巴酚丁胺引起的反应。数值显示为平均值±SEM*P（P）与野生型相比，<0.05。
图4
图4。GRMD犬先前存在的纤维化病变和心室容积。
(一)GRMD犬和野生型犬急性输注P188前后舒张末期容积的评估。数值显示为平均值±SEM(B类)未经治疗的成年GRMD动物的典型天狼星红染色组织病理切片。在亮场图像中（左），胶原蛋白呈红色；在偏振光下，天狼星红色染色的胶原蛋白表现出双折射，使其可视为绿色光线（右）。上面的图像显示一个大的病变，伴有广泛的纤维化和退化的心肌细胞。下图显示了穿过相对正常心肌区域的胶原链（箭头所示）。(C类)野生型心肌的相同染色。比例尺：100μm。
图5
图5。GRMD动物长期服用P188期间的疾病生物标志物总结。
(一)P188慢性给药研究设计大纲(n个=4）或盐水(n个=4）在GRMD动物中。(B类–E类)慢性输液期间每两周采集一次样本的血清化学数据；显示的是(B类)cTnI（虚线表示野生型犬只值）(C类)CK公司(D类)天冬氨酸转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP），以及(E类)血尿素氮（BUN）和肌酐。数值显示为平均值±SEM；每组4-8只动物*P（P）<0.05，双向方差分析显示治疗效果显著。
图6
图6。慢性P188治疗限制了GRMD动物的心肌纤维化并阻断了BNP升高。
(一)心肌切片的天狼星红染色显示GRMD心脏广泛纤维化。胶原蛋白在亮场图像中呈红色，在偏振图像中呈黄绿色。比例尺：400μm。(B类)每组4只狗的16-24个切片中胶原蛋白含量的定量。(C类)慢性输液方案之前（GRMD-Pre）和之后的血清BNP水平。数值显示为平均值±SEM；每组4-8只动物*P（P）与野生型相比<0.05；‡P（P）与GRMD（生理盐水）组相比，<0.05。所有数据均采用单因素方差分析和Bonferroni多重比较事后检验进行分析。
图7
图7。八周的P188给药可防止GRMD动物的LV重塑。
基于导管的心室内记录显示接受盐水输注的GRMD犬的心室重构显著。(一和B类)处理前压力-体积回路的代表性轨迹(一)以及在慢性输液方案之后(B类). (C类)在最终血流动力学方案期间监测左室舒张末期容积。最左边的偏移是慢性输液前初始血液动力学方案的基线数据*P（P）<0.05（见方法）。(D类–F类)多巴酚丁胺反应峰值期间（输注后约10分钟）的血流动力学数据比较；左心室压力τ(D类)，舒张末期容积(E类)和收缩末期容积(F类). 每组由3-4只狗组成。‡P（P）<0.05 byt吨测试。对于C类–F类，值显示为平均值±SEM。
图8
图8。慢性输注后完整GRMD心肌细胞的体外被动张力-伸展关系。
输注8周后，从P188（红色）和盐水（蓝色）GRMD和野生型犬中分离出心肌细胞。缺乏营养不良心肌细胞的被动张力-伸展关系(一)和存在(B类)μM P188的急性应用。黑色曲线B类来源于野生型心肌细胞数据一并作为参考。SL，肌节长度。(C类)各组之间最大稳定肌节长度（Max SL）的比较*P（P）与野生型相比<0.05；†P（P）与慢性盐水GRMD组相比<0.05；‡P（P）与慢性P188 GRMD组相比<0.05。数值显示为平均值±SEM。所有点均来自4-5只狗的5-7个心肌细胞。所有数据均采用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较事后检验进行分析。总经理、总经理。
图9
图9。GRMD心脏中的Utrophin表达。
(一)对从野生型和GRMD犬心脏分离的utrophin和dystrophin KCl洗涤的粗微粒体膜进行Western blot分析。(B类)定量研究中观察到的utrophin表达水平一.
图10
图10。GRMD动物严重心肌病的细胞基础模型。
(一)膜接触心肌细胞被动张力-延伸曲线示意图。在肌营养不良蛋白存在的情况下，心肌细胞在整个工作肌节长度范围内（黑线）表现出顺应性。如GRMD心肌细胞所示，在缺乏肌营养不良蛋白的情况下，心肌细胞变得非常不顺从，对被动伸展（灰线）具有抵抗力。营养素上调部分恢复肌营养不良蛋白缺陷肌细胞的被动伸展张力特性（虚线），如图中密度纤维板肌细胞。(B类)描述野生型动物中肌营养不良蛋白（蓝色）正常机械稳定功能的细胞模型。在野生型心肌细胞中，在被动细胞延伸（下图）时，肌营养不良蛋白保护细胞膜免受损伤。在中密度纤维板肌细胞，肌营养不良蛋白缺失，但utrophin（红色）上调，部分取代了肌营养不良素的机械缓冲特性。这提供了一些但不是完全保护膜免受机械损坏。因此，随着细胞的延伸，会出现一些膜损伤。在肌营养不良蛋白缺乏的狗心肌细胞（GRMD）中，utrophin没有上调。因此，随着细胞的延伸，细胞膜受到更多的损伤。
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