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.2010年5月7日；285(19):14534-48.
doi:10.1074/jbc。M110.115345。 Epub 2010年3月15日。

表观遗传调控机制区分干细胞和成纤维细胞中维甲酸介导的转录反应

瓦森德拉·卡西亚普 1, 洛林·J·古达斯
附属公司

表观遗传调控机制区分干细胞和成纤维细胞中维甲酸介导的转录反应

瓦森德拉·卡西亚普等。 生物化学杂志. .

摘要

维甲酸（RA）是一种维生素a代谢产物，通过与RA受体（RAR）和类视黄醇X受体（RXR）异二聚体结合来调节转录。这种转录反应由受体与转录调节蛋白和染色质修饰蛋白的相互作用决定。我们比较了三个RA靶基因（Hoxa1、Cyp26a1、RARbeta（2））在初级胚胎成纤维细胞（小鼠胚胎成纤维纤维细胞）、永生化成纤维细胞和F9畸胎瘤干细胞中的转录反应。Hoxa1和Cyp26a1转录物不表达，但RA在小鼠胚胎成纤维细胞和Balb/c3T3细胞中诱导RARbeta（2）转录物。维甲酸受体（RARgamma、RXRapha）、辅激活物（pCIP（NCOA3、SRC3））、p300和RNA聚合酶II仅被招募到Balb/c3T3中的RARbeta（2）RA反应元件（RARE）中，而这些蛋白被F9细胞中的RA招募到所有三个基因的RARE中。在F9中，RA减少了多梳（PcG）蛋白Suz12和所有三个基因RARE处相关的H3K27me3抑制性表观遗传修饰。相反，在+/-RA培养的Balb/c3T3细胞中，Suz12与Hoxa1、RARbeta（2）和Cyp26a1 RARE无关，而在这些RARE中可以看到H3K27me3标记的缓慢水平。因此，在没有RA的情况下，Suz12不需要进行基因抑制。尽管Hoxa1 RARE和近端启动子在Balb/c3T3中显示高水平的H3K9、K14乙酰化，但Hoxa1基因并未被RA激活。在Balb/c3T3中，CpG岛在Cyp26a1启动子区甲基化，但在Hoxa1启动子或F9细胞的这些启动子中没有甲基化。我们描述了控制成纤维细胞与干细胞中RA-介导转录的复杂机制。

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数字

图1。
图1。
a–c，RA调节诱导Cyp26a1细胞,霍克萨1、和风险调整比率β2显示了F9-Wt和Balb/c3T3细胞中的转录物。用1μ米RA用于不同时间点（0、8、24、48和72小时），并反向转录以生成cDNA。获得的cDNA用于实时PCR（定量）分析。三个基因的实时PCR数据绘制（以任意单位）与36立方英尺4英寸每个点的mRNA。使用独立的RNA样本进行了至少三次实验，每个独立实验都获得了类似的结果。实时PCR一式三份，结果代表两个独立的生物学实验（平均值±S.E.）。这个星号描述重要性，其中1个星号表示第页<0.05和2个星号表示第页< 0.01.d日显示了F9 Wt和Balb/c3T3细胞中RARα和RARγmRNA诱导的时间进程。用1μ米RA持续不同时间（0、8、24、48和72小时）并反向转录到cDNA。获得的cDNA用于半定量PCR分析。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色后进行可视化。e（电子），mRNA诱导的时间进程Cyp26a1细胞,霍克萨1、和风险调整比率β2在F9 Wt细胞和原代MEFs中显示。从F9 Wt中提取RNA，用1μ米RA作用不同时间（0、8、24、48和72小时）并反转录形成cDNA。获得的cDNA用于半定量PCR分析。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色后进行可视化。
图2。
图2。
RARγ关联 和RXRα 具有霍克萨1,风险调整比率β2、和Cyp26a1细胞F9 Wt和Balb/c3T3细胞中的稀有元素。 一，所示为的基因结构示意图霍克萨1,Cyp26a1细胞、和风险调整比率β2黑线表示DNA。灰色方框表示内含子，外显子由黑匣子每个基因内的RARE由箭头，实际结合位点如所示粗体字母。RARE下方的粗黑条表示ChIP分析中扩增的区域。每个基因中的转录起始位点由弯曲的箭头.此图按比例绘制。b–f用RA处理F9 Wt和Balb/c3T3细胞不同时间（0、8和24 h），然后使用两步交联程序进行交联。细胞首先用2 m培养米戊二酸二丁二酰亚胺，轻轻摇晃45min，然后用1%甲醛固定。收集交联细胞并在裂解缓冲液中进行裂解，然后进行超声处理以获得可溶性染色质。染色质来自～3.5×106细胞用于每个IP，染色质样品用蛋白A-Sepharose珠进行预处理。隔夜用RARγ、RXRα和IgG抗体免疫沉淀预清除的染色质。结合的染色质由蛋白A-琼脂糖珠拉下，洗涤、洗脱、反向交联和纯化。免疫沉淀DNA（2μl）用于实时PCR。实验从细胞开始重复至少三次，并进行三次定量PCR。数据被绘制为富集倍数，其定义为在特定位点免疫沉淀的输入DNA的百分比除以在非特异性区域免疫沉淀的输入DNA的百分比(霍克斯b1-18 kb 3′）。使用Graphpad Prism 4.0对数据进行统计分析误差线在独立重复实验中显示S.E。这个星号描述重要性，其中1个星号表示第页<0.05和2个星号表示第页< 0.01.第页这些值表明，与该细胞系未经治疗的对照组相比，RA治疗后每个细胞系内的变化具有统计学意义。请注意年轴刻度输入面板dF9 Wt和Balb/c3T3电池之间。
图3。
图3。
辅激活因子募集（pCIP和p300）霍克萨1,风险调整比率β2、和Cyp26a1细胞RA治疗后F9 Wt和Balb/c3T3细胞中的RARE。用RA处理F9Wt和Balb/c3T3细胞不同时间（0、8和24 h），并用1%甲醛固定。对细胞进行裂解和超声处理，以获得可溶性染色质。染色质被预先清除，并用抗pCIP或抗p300抗体进行免疫沉淀，并使用实时PCR对免疫沉淀的DNA进行定量。从细胞开始，每个实验至少重复三次，并进行三次定量PCR。数据绘制为倍富集，即特定位点输入DNA免疫沉淀的百分比除以非特定区域输入DNA免疫沉积的百分比(霍克斯b1-18 kb 3′）。计算平均富集倍数误差线在独立的重复实验中代表S.E。1个星号表示第页<0.05，以及2个星号表示第页< 0.01.第页这些值表明，与该细胞系的未处理对照相比，RA处理后每个细胞系内发生了显著变化。
图4。
图4。
Pol II的招募霍克萨1,风险调整比率β2、和Cyp26a1细胞RA治疗后F9 Wt和Balb/c3T3细胞中的RARE。用RA处理F9-Wt和Balb/c3T3细胞不同时间（0、8和24小时），并用1%甲醛固定。对细胞进行裂解和超声处理以获得可溶性染色质。用抗pCTDser5抗体对染色质进行预处理和免疫沉淀，并用实时PCR对免疫沉淀DNA进行定量。从细胞培养开始，至少进行了三次实验，并进行了三份定量PCR。数据平均并绘制为免疫沉淀DNA的百分比，参考每个位点输入DNA的百分比。这个误差线在独立的重复实验中代表S.E。输入DNA在同一IP中免疫沉淀的百分比霍克斯b1-还绘制了18kb3′区作为阴性对照进行比较。1个星号表示第页<0.05，以及两个星号表示第页< 0.01.第页这些值表明，与该细胞系未经治疗的对照组相比，RA治疗后每个细胞系内发生了显著变化。请注意，在霍克萨1PP区：在有RA和无RA培养的Balb/c3T3细胞中Pol II水平相似，但在统计学上显著高于霍克斯b1-18 kb 3′区(第页< 0.05).
图5。
图5。
组蛋白乙酰化状态霍克萨1,风险调整比率β2、和Cyp26a1细胞F9-Wt和Balb/c3T3细胞对RA治疗的反应中的RARE。用RA处理F9Wt和Balb/c3T3细胞不同时间（0、8和24 h），并用1%甲醛固定。对细胞进行裂解和超声处理，以获得可溶性染色质。用抗H3K9、K14ac对染色质进行预处理和免疫沉淀，并使用实时PCR对免疫沉淀DNA进行定量。从细胞培养开始，实验重复至少三次，并进行三次定量PCR。将数据平均并绘制为免疫沉淀DNA的百分比，参考每个位点输入DNA的百分比。这个误差线在独立的重复实验中代表S.E。非特异性IgG阴性对照的同一染色质提取物中输入免疫沉淀的百分比和霍克斯b1-还绘制了18kb3′区的图像，以进行比较。1个星号表示第页< 0.05,两个星号表示第页<0.01，以及三个星号表示第页< 0.0005.第页这些值表明，与IgG控制相比，每个位点的H3K9、K14ac水平显著升高（包括霍克斯b1-18 kb 3′区）。
图6。
图6。
a–e，Suz12在霍克萨1,风险调整比率β2、和Cyp26a1细胞显示了F9 Wt和Balb/c3T3细胞对RA治疗的反应中的RARE。用RA处理F9Wt和Balb/c3T3细胞不同时间（0、8和24 h），并用1%甲醛固定。对细胞进行裂解和超声处理，以获得可溶性染色质。用抗SUZ12抗体对染色质进行预处理和免疫沉淀，并用实时PCR对免疫沉淀DNA进行定量。从细胞培养开始，实验重复至少三次，并进行三次定量PCR。将数据平均并绘制为免疫沉淀DNA的百分比，参考每个位点输入DNA的百分比。这个误差线在独立的重复实验中代表S.E。同一染色质提取物中输入的免疫沉淀物与非特异性IgG的百分比也用图表表示，以作为阴性对照进行比较。1个星号表示第页<0.05，以及两个星号表示第页< 0.01.第页这些值表明，与该细胞系未经治疗的对照组相比，RA治疗后每个细胞系内的变化具有统计学意义。（f）显示了F9 Wt细胞和Balb/c3T3细胞中Suz12 mRNA的水平。用1μ米RA作用不同时间（0、8、24、48和72小时）并反转录形成cDNA。将获得的cDNA用于半定量PCR分析。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色后进行可视化。克图中显示了Suz12蛋白在F9 Wt和Balb/c3T3细胞中的表达。用1μ米RA持续不同时间（0、8、24、48和72小时）。在10%SDS-PAGE上分离全细胞提取物（60μg），然后用抗Suz12（1:1000）进行Western blot分析。β肌动蛋白抗体免疫印迹（1:1000）作为负荷对照。
图7。
图7。
H3K27me3水平霍克萨1,风险调整比率β2、和Cyp26a1细胞RA治疗后F9 Wt和Balb/c3T3细胞中的RARE。用RA处理F9Wt和Balb/c3T3细胞不同时间（0、8和24 h），并用1%甲醛固定。对细胞进行裂解和超声处理，以获得可溶性染色质。用抗H3K27me3抗体对染色质进行预筛选和免疫沉淀，并使用实时PCR对免疫沉淀的DNA进行定量。实验从细胞培养开始重复至少三次，定量PCR分三次进行。将数据平均并绘制为免疫沉淀DNA的百分比，参考每个位点输入DNA的百分比。这个误差线在独立的重复实验中代表S.E。同一IP中输入的免疫沉淀物与非特异性IgG的百分比也绘制成图表，以作为阴性对照进行比较。第页这些值表明，与未经治疗的对照组相比，RA治疗后每个细胞系内发生了显著变化。请注意，在霍克萨1,风险调整比率β2、和Cyp26a1细胞RARE，在有无RA培养的Balb/c3T3细胞中H3K27me3的水平相似，并且在统计学上显著高于IgG阴性对照组的水平(第页< 0.05).
图8。
图8。
CpG甲基化状态Cyp26a1细胞(一)和霍克萨1(b)近端启动子区。从F9 Wt和Balb/c3T3细胞中分离出基因组DNA，并通过亚硫酸氢处理进行修饰。亚硫酸氢盐特异性引物设计跨越了TSS附近的CpG岛塞浦路斯26a1和霍克萨1加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器对所使用的CpG岛区域进行了注释。黑色方块表示甲基化CpG，而白色方块对应于未甲基化的CpG。数据来自转换后产生的多个菌落的序列。该基因由水平线，CpG二核苷酸的位置由基因上方的椭圆形圆圈。正向和反向引物由基因下方的水平线.此图未按比例绘制。
图9。
图9。
F9 Wt和Balb/c3T3细胞中三个RA调节基因的差异转录调控模型。RA信号启动后，PcG蛋白Suz12从霍克萨1,Cyp26a1细胞、和风险调整比率β2基因和霍克萨1F9 Wt细胞中的PP区域。然而，低水平的PcG介导的H3K27me3修饰与Cyp26a1细胞和霍克萨1Balb/c3T3细胞中的RARE（未描述）。RARγ和RXRα、辅活化因子和RNA Pol II在霍克萨1稀有和Cyp26a1细胞Balb/c3T3细胞中的稀有元素，与F9 Wt细胞中的情况相反。这与RA-介导的转录激活霍克萨1和Cyp26a1细胞F9 Wt细胞中，但Balb/c3T3细胞中没有。中的CpG岛Cyp26a1细胞该基因仅在Balb/c3T3细胞中甲基化，与缺乏转录反应相关。RARγ和RXRα在风险调整比率β2在无RA和有RA的情况下，F9 Wt和Balb/c3T3细胞中均罕见。共激活子pCIP、p300和RNA Pol II被招募到风险调整比率β2Balb/c3T3细胞中罕见，类似于F9 Wt细胞的情况，这对应于RA在两种细胞类型中的转录激活。
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