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.2010年3月15日；207(3):535-52.
doi:10.1084/jem.20092121。 Epub 2010年2月22日。

博莱霉素和IL-1介导的肺纤维化依赖IL-17A

马克·威尔逊 1, 萨蒂什·马达拉, Thirumalai R Ramalingam公司, Bernadette R Gochuico公司, 伊凡·罗莎斯, 艾伦·W·契弗, 托马斯·韦恩
附属公司

博莱霉素和IL-1介导的肺纤维化依赖IL-17A

马克·威尔逊等。 实验医学杂志. .

摘要

特发性肺纤维化（IPF）是一种破坏性炎症性疾病，治疗方法有限。为了更好地了解胶原沉积之前和之后的炎症反应，我们使用了三种肺纤维化模型，并确定了IL-17A的关键机制作用。暴露于博莱霉素（BLM）（而非曼氏血吸虫卵）后，CD4（+）和γ（+）T细胞产生的IL-17A可诱导显著的中性粒细胞增多和肺纤维化。对C57BL/6 il17a（-/-）小鼠进行的研究证实了IL-17A的重要作用。从机制上讲，我们使用ifngama（-/-）、il10（-/-/）、il10-（-/-）il12p40（-/--）和il10-。BLM诱导的IL-17A产生也是TGF-β依赖性的，重组IL-17A-介导的纤维化需要TGF-α，这表明IL-17A和TGF-γ在纤维化发展中具有协同作用。最后，我们发现IL-1β诱导的纤维化（模拟BLM诱导的纤维化）也高度依赖于IL-17A。IPF患者支气管肺泡灌洗液中IL-17A和IL-1β也增加。总之，这些研究确定了IL-17A在纤维化中的关键作用，说明了靶向IL-17A在药物和炎症诱导的纤维化治疗中的潜在效用。

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数字

图1。
图1。
IL-13依赖性和非依赖性肺纤维化。重量，第13页−/−，或il13Rα2−/−给小鼠5000只曼索尼鸡蛋i.p.然后是5000个曼索尼静脉注射14天后，在7天后评估肺纤维化肉芽肿（d21；A和B），或气管内注射0.15U BLM，在第7天评估肺纤维化（C和d）。显示了两个独立实验中的一个，每组五只动物。（A和C）肺胶原蛋白沉积，表示为每个肺的羟脯氨酸微孔。所示数据为平均值±SEM。（B和D）石蜡包埋肺组织的5µm切片用Masson’s Trichrome染色。图像以10倍的放大倍数显示。胶原蛋白，蓝色；细胞核，深红色；细胞质，红色/粉红色。棒材，60µm。
图2。
图2。
BLM诱导纤维化过程中IL-17A和IFN-γ的产生。如图1所示，通过气管内给WT小鼠注射0.15U BLM，并在第0天到第21天分析局部免疫特征和组织病理学评估，如图所示。显示了三个独立实验中的一个，每组五只动物。显示的数据为平均值±SEM。（A）如图所示，在BLM后的几个时间点评估的体重减轻。（B） 组织切片的肺胶原蛋白评分。（C） 从肺组织中提取RNAtimp-1型,基质金属蛋白酶12、和专业–COL-3mRNA定量RT-PCR。（D） 在BLM后指定的第二天从小鼠身上获得的5µm石蜡包埋肺组织切片，并用Masson’s Trichrome染色。图像以5倍的放大倍数显示。棒材，60µm。（E） 分离BAL、肺和肺引流性胸椎LN（t:LN）细胞，并用抗CD3ε刺激4 d。用ELISA测定培养上清液中的IL-17A、IFN-γ和IL-13。（F） 在偏振光下显示用Giemsa或Picrosirius红（插图）染色的BLM后第7天从小鼠获得的石蜡包埋的肺组织的5µm切片。图像以10倍的放大倍数显示。棒材，60µm。
图3。
图3。
产生IL-10的CD4细胞在肺部积聚。给予C57BL/6 IL-10 0.15 U BLM绿色荧光粉小鼠通过气管内途径，如图1所示。两个独立实验之一，每组五只动物。数据显示为平均值±SEM。（A）从IL-10中分离出肺、BAL或胸部LN细胞绿色荧光粉报告小鼠并用抗小鼠CD3和CD4染色。水平条显示平均值。（B） CD4细胞+白介素-10绿色荧光蛋白−和CD4+白介素-10绿色荧光粉+在第7天，从BLM处理小鼠的肺中分离出FACS细胞（纯度>98%）。提取RNA并分析mRNA转录物。虚线表示原始CD4+细胞。
图4。
图4。
IL-10限制IL-17A和IFN-γ以及肺纤维化的程度。给WT和IL-10注射0.15 U BLM绿色荧光粉，或il10号机组−/−小鼠，通过气管内途径，如图1.*所示，采用Mann-Whitney检验，P<0.05。显示了三个独立实验中的一个，每组五只动物。所示数据为平均值±SEM。（A）肺胶原沉积，表示为每个肺的羟脯氨酸微孔。（B） 用抗CD3ε刺激胸部LN细胞，在培养上清中测量IL-17A或IFN-γ。使用Sircol分析法从BAL液中定量BAL胶原蛋白。（C） BLM后第7天分离的肺细胞在BFA存在下用PMA和离子霉素短暂刺激后，用抗小鼠、CD4、CD8、B220、γδTCR、NK1.1、IL-17A和IFN-γ染色。CD4的百分比+或γδ+表中列出了产生IL-17A的细胞，以及从肺部回收的细胞总数。（D） 用酶联免疫吸附试验（ELISA）对均质肺上清液进行所示细胞因子/趋化因子的检测。
图5。
图5。
IL-12/23p40缺乏显著影响IL-17A和IFN-γ，并抑制肺纤维化。给WT 0.15 U BLM，il10号机组−/−,il12/23p40−/−，或il10号机组−/−il12/23p40−/−小鼠通过气管内途径，如图1.*所示，采用Mann-Whitney检验，P<0.05。显示了两个独立实验中的一个，每组五只动物。所示数据为平均值±SEM。（A）取自WT或il10号机组−/−BLM后第7天或第21天，用Masson’s Trichrome染色。图像以5倍放大率显示，插图中的虚线方框以40倍放大。棒材：60µm；（插图）7µm。（B） 使用Sircol分析法从BAL液中定量肺损伤（以BAL胶原计）。（C） 肺胶原蛋白沉积，表示为每个肺的羟脯氨酸微孔。（D） 循环多形核细胞（PMN）的绝对计数来自CBC计数。（E和F）用抗CD3ε刺激胸部LN细胞，并在培养上清液中测量IL-17A（E）和IFN-γ（F）。（G） 在BFA存在下用PMA和离子霉素短暂刺激后，用抗小鼠CD4、CD8、B220、γδTCR、NK1.1、IL-17A和IFN-γ染色胸膜LN细胞。CD4上显示的数据是门控的+细胞。
图6。
图6。
肺纤维化减轻il17a型−/−老鼠。给WT 0.15 U BLM，il10号机组−/−,第17层−/−，或il10号机组−/−il17a型−/−小鼠，通过气管内途径，如图1.*所示，采用Mann-Whitney检验，P<0.05。显示了两个独立实验中的一个，每组五只动物。所示数据为平均值±SEM。（A）肺损伤，以BAL胶原测量，使用Sircol分析从BAL液中定量。（B） 肺胶原蛋白沉积，表示为每个肺的羟脯氨酸微孔。（C） 循环多形核细胞的绝对计数来自CBC计数。（D） BLM后7天的重量变化百分比。（E） 取自WT或il10号机组−/−BLM后第7天或第21天，用Masson’s Trichrome染色。图像以40倍的放大倍数显示。棒，7µm。（F） 从肺组织中提取RNA，用定量RT-PCR定量显示mRNA。（G和H）用抗CD3ε刺激胸部LN细胞，在培养上清中测量IL-17A（G）和IFN-γ（H）。（一） 酶谱法测定BAL中MMP2和MMP9的生物活性。
图7。
图7。
IL-17A依赖性IL-1β诱导胶原沉积。给小鼠气管内注射0.15 U BLM、1µg IL-1β、1μg IL-17A或IL-1β和IL-17A各0.5µg，并在第7天评估肺胶原沉积。*，采用Mann-Whitney检验，P<0.05。显示了两个独立实验中的一个，每组五只动物。所示数据为平均值±SEM。石蜡包埋肺组织的（A和E）5µm切片用Masson’s Trichrome染色。图像以20倍的放大倍数显示。棒材，20µm。（B和F）肺胶原沉积，表示为每个肺的羟脯氨酸微孔。（C和I）用抗CD3ε刺激胸部LN细胞，并在培养上清中测量IL-17A和IFN-γ。（D） 酶谱法测定BAL液中MMP2的生物活性。（G） 循环多形核细胞的绝对计数来自CBC计数。（H） ELISA法检测BAL液TIMP-1和IFN-γ。
图8。
图8。
IL-17A依赖性纤维化需要TGF-β。在第-1、3和5天，给小鼠气管内注射0.15 U BLM或1µg IL-17A，并给予或不给予500µg抗TGF-β治疗。在第7天评估肺胶原蛋白沉积。*，采用Mann-Whitney检验，P<0.05。显示了两个独立实验中的一个，每组五只动物。显示的数据为平均值±SEM。（A）肺损伤，以BAL胶原测量，使用Sircol测定法从BAL液中定量。（B） 肺胶原蛋白沉积，表示为每个肺的羟脯氨酸微孔。（C） 用抗CD3ε刺激胸部LN细胞，并在培养上清中测量IL-17A和IFN-γ。（D） 5µm石蜡包埋肺组织切片用Masson’s Trichrome染色。图像以20倍的放大倍数显示。棒材，20µm。
图9。
图9。
人IPF患者BAL液中IL-17A和IL-1β升高。收集了NV和IPF患者的BAL液和肺活检。（A） ELISA法检测BAL液中IL-17A和IL-1β的含量。（B） 从石蜡包埋的肺活检中切下5µm的肺切片，并用Masson三色染色。所示数据为平均值±SEM。图像以5倍（顶部）显示，虚线矩形以20倍（底部）放大。棒材：（顶部）60µm；（底部）20µm。
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