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.2010年2月8日4:1。
doi:10.3389/neuro.05.001.2010。 2010年电子收藏。

SAT1，一种谷氨酰胺转运蛋白，在GABA能神经元中优先表达

汤姆·塔勒克·索尔布 1, 莫娜·比约尔克莫, 保罗·伯吉斯, 蒂博尔·哈卡尼, Farrukh A Chaudhry公司
附属公司

SAT1，一种谷氨酰胺转运蛋白，在GABA能神经元中优先表达

汤姆·塔勒克·索尔布等。 前神经元. .

摘要

GABA能神经元的子集能够维持高频放电模式，这需要有效补充GABA的可释放池。虽然谷氨酰胺被认为是GABA的首选前体，但参与GABA能神经元摄取谷氨酰胺的转运体的身份仍不清楚。分子分析表明，SAT1（Slc38a1）具有系统A特征，对谷氨酰胺具有优先亲和力，并且SAT1 mRNA表达与GABA能神经元相关。通过产生针对SAT1的特异性抗体，我们表明这种谷氨酰胺载体在GABA能神经元中特别丰富。细胞内SAT1的分布类似于GAD67的分布，GAD67是一种必需的GABA合成酶，表明SAT1可能参与将谷氨酰胺转移到GABA能神经元中，以促进抑制性神经递质的生成。

关键词：GAD67；SNAT1；Slc38a1；谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环；中间神经元；神经递质；细小白蛋白；系统A。

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图1
图1
抗SAT1抗体的特征.（A）用含有SAT1 N末端的GST融合蛋白免疫两只兔子。通过对瞬时转染SAT1（1）、SAT2（2）或模拟载体（3）的COS细胞提取物进行免疫印迹，对获得的血清进行特异性测试。两种抗体均显示仅限于SAT1转染细胞提取物的免疫反应（结果仅显示抗SAT1-N1）。（B）用SDS-PAGE分离的大鼠脑提取物对SAT1选择性血清进行亲和纯化和检测。两种抗体（1和2）均获得了接近50kDa的宽带。抗SAT1-N2抗体检测到另外两条分子量较高的细长条带（2）。（C）瞬时转染FLAG标记的SAT1的分化PC12细胞用SAT1-N1抗体双重染色（C′）和一种针对FLAG表位的商业抗体（C〃）图像叠加显示，这两种抗体染色于PC12细胞的同一亚群。注意，染色发生在细胞体及其过程中。还要注意，未经抗FLAG免疫染色的细胞也未经SAT1免疫染色。（D）SAT1（绿色；D′)靶向突触素（红色；D〃)，一种囊泡蛋白，用于区分分化的SAT1转染PC12细胞的轴突末端。请注意，邻近的假定未转染细胞对突触素染色强烈，但无法通过SAT1抗体进行免疫染色。（E）分化的SAT1转染PC12的SAT1和syntaxin-6（stx6）的双重标记反式-高尔基网络在核周区显示出明显的共定位。所有部分均已由DAPI（蓝色）复染。比例尺：20μm。
图2
图2
几个脑区神经元亚群中SAT1的显著免疫过氧化物酶染色.（A）游离矢状窦旁脑切片的免疫组织化学染色显示SAT1在许多亚区定位。丘脑、中脑区和小脑的染色强度最高，而皮层、海马体和纹状体的染色水平相对较低。（B）当抗体与用于免疫兔子的GST融合蛋白预先孵育时，强烈的SAT1样免疫反应被消除（结果显示为抗SAT1-N1）。（C、D）通过两种抗体（抗SAT1-N1和抗SAT1-N2）在丘脑网状核（Rt）中检测到显著的细胞SAT1免疫反应C类和D类）。丘脑腹侧后外侧核（VPL）也含有分散的SAT1免疫反应细胞，尽管染色不那么强烈。内囊（ic）中检测到极少的SAT1免疫标记细胞。（E）脑干的脑桥核（Pn）富含SAT1免疫反应。在外侧上橄榄（LSO）和面神经核（7n）中也检测到SAT1免疫染色细胞。强免疫染色的神经元样细胞出现在桥脑网状核（PnO）的口腔部分，其中SAT1免疫反应性分布在细胞体及其过程中（插图）。（F）延髓网状结构中有分散的神经元，SAT1免疫染色强。插图显示，一些富含强烈SAT1免疫染色的神经元样细胞分布在其整个细胞延伸区域，包括其过程。（G）在外侧嗅束核的神经元样细胞中检测到显著的SAT1免疫标记。（H）在脊髓中，灰质（Gm）中的神经元样细胞中检测到中等至强的SAT1免疫染色。脊髓白质（W）中未检测到免疫染色的细胞体。（一）小脑颗粒细胞层（G）SAT1的表达在一些细胞体较大的散在神经元中尤为显著，类似高尔基中间神经元（I），而颗粒细胞（g）则有微弱的免疫标记（插图）。Purkinje细胞也通过亲和纯化的抗SAT1抗体进行免疫染色（箭头；下插图）。小脑核（Cbn）含有SAT1免疫染色强的散在细胞。在白质（W）中几乎没有发现任何染色细胞。名称：*，中央运河；7n，面神经核；Cb，小脑；Cbn，小脑核（中间核）；cc，胼胝体；CPu，尾状壳核；Cx，皮层；耳蜗背核；Fr，额叶皮层；G、 颗粒细胞层；g、 颗粒细胞；Gm，灰质；苍白球；Hc，海马；一、 中间神经元；IC，下丘；lo，侧嗅束；LL，外侧丘系核；LSO，侧上橄榄；LV，侧脑室；M、 分子层；P、 浦肯野细胞层；梨状皮质；Pn，脑桥核；PnO，脑桥网状核，口腔部分；Pu、Purkinje细胞；丘脑网状核；SC，上睑；SN，黑质；Th，丘脑；涂，嗅结核；丘脑腹后外侧核；W、 白质；ZI，不确定地带。比例尺：20μm（插入我)，40微米(G公司，插图E类和F类)，100微米(C–F、H、I)，350微米（A）.
图3
图3
基底节神经元在其胞体及其突起中表现出强烈的SAT1免疫反应.（A）苍白球（GP）富含SAT1免疫反应神经元。在尾壳核（CPu）中也检测到较小的、分散的、对SAT1进行强烈免疫染色的神经元样细胞（箭头所示）。（B）苍白球神经元的高倍光显微镜显示，细胞体及其过程中存在SAT1免疫染色。请注意，免疫染色仅限于质膜（箭头所示）。（C）在黑质网状部分（SNR），神经元细胞体及其突起被强烈标记为SAT1。黑质致密部（SNC）显示SAT1免疫染色广泛存在于神经膜和一些较小的细胞体中。（D）在尾顶叶中，一个神经元样细胞被染色为SAT1。请注意，染色出现在细胞体及其过程中（箭头）。CPu，尾壳核；苍白球；黑质致密部；SNR，黑质网状部。比例尺：20μm（B、D），80微米（A、C）.
图4
图4
皮层神经元亚群中SAT1免疫反应性的差异.（A）新皮质的所有层均检测到SAT1免疫反应细胞。第三层和第五层在神经膜上呈弥漫性染色的宽条带。（B）在第五层中，在分散的小神经元样细胞（箭头）中检测到SAT1的强免疫染色，而较大的金字塔样细胞（箭头）则为中度或弱免疫标记。I–VI：第1–VI层。比例尺：100μm（B），200微米（A）.
图5
图5
海马中间神经元富含SAT1免疫染色.（A）海马结构含有分散的细胞，SAT1免疫染色强，而主要细胞免疫染色弱。神经膜在主细胞（P和G）和腔隙分子层（LM）附近中度染色。（B）SAT1抗体与用于免疫的融合蛋白预孵育后，SAT1免疫染色被取消。（C）高倍光显微镜证实非锥体细胞的SAT1免疫染色很强，并且它们在CA1标记微弱的锥体细胞之间的过程也很强。可见细胞内染色结构。（D）CA1层有两个SAT1免疫染色细胞。注意，SAT1免疫反应性延伸到其突起的远端。（E）齿状区也有SAT1染色强烈的散在细胞。注意其显著的SAT1染色过程。（F）一种SAT1免疫染色神经元，其胞体位于颗粒细胞层的基底部。注意，它在未染色颗粒细胞（g）和沿颗粒细胞层内边界的水平突起之间垂直延伸免疫染色过程（箭头）。G、 颗粒细胞层；g、 颗粒细胞；H、 门；LM，腔隙分子层；M、 齿状区的地层分子；O、 地层定向；P、 金字塔层；p、 锥体细胞；R、 放射状地层。比例尺：20μm（C、D、F），75微米（E），150微米（A、B）.
图6
图6
SAT1免疫染色在GAD67/PARV中显著+神经元，靶向包含轴突节段的VGAT将敲入GAD67位点的杂合表达绿色荧光蛋白（GFP）的年轻成年小鼠灌流固定，并对SAT1和细胞标记物进行免疫荧光标记。（A）在新皮质（L2/3）和海马中，SAT1免疫反应性积聚在GABA能中间神经元亚群的体脂结构域中，该中间神经元也含有PARV(箭头). 箭头表示SAT1/GAD67绿色荧光粉/+-属于中间神经元其他亚类的GABA阳性中间神经元。（B）基底神经节SAT1和PARV免疫反应的共放大。三联标记神经元及其过程呈白色/浅粉色。请注意，苍白球（GP）和丘脑网状核（RTN）中几乎所有含有PARV的神经元都表达SAT1。开矩形表示RTN中大多数GABA能神经元的图像位置（C）.（C）通道分离揭示了RTN中SAT1和PARV免疫反应的共同定位。箭头指向选择带三个标签的单元格。（D）黑质中缺乏PARV免疫反应的SAT1免疫反应性GABA能神经元网状部.（E、F）海马PARV+分离中间神经元并培养12天在体外大量SAT1免疫反应仅在共同表达神经元周围网络成分的细胞中发现（如多花紫藤凝集素结合）和囊泡GABA转运蛋白（VGAT）。箭头指向三个标签的静脉曲张轴突结构。缩写：CPu，尾状壳核；苍白球；或，地层定向；金字塔层；rad，辐射层；RTN，丘脑网状核。比例尺=4μm（F），14微米（E），30微米（A、C、D），100微米（B）.
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