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。2010年2月5日；6(2):153-66.
doi:10.1016/j.stem.2009.12.014。

多梳样2与PRC2相关并调节小鼠胚胎干细胞自我更新和分化过程中的转录网络

艾米丽·沃克 1, 永永昌, 朱莉·亨卡皮勒, 杰拉德·卡格尼, 卡马尔·加查, 约瑟夫·托奇亚, Nevan J Krogan先生, 杰里米·弗雷特, 威廉·斯坦福
附属公司

多梳样2与PRC2相关并调节小鼠胚胎干细胞自我更新和分化过程中的转录网络

艾米丽·沃克等。 细胞干细胞。 。

摘要

多梳组（PcG）蛋白是保守的表观遗传转录阻遏物，控制许多发育基因表达程序，最近被认为参与调节胚胎干细胞（ESC）的命运。我们在全基因组的自我更新和多能性调节器筛选中鉴定了PcG蛋白PCL2（polycomb-like 2），并预测其在小鼠ESC-fate测定中发挥重要作用。通过多种生化策略，我们证明PCL2是小鼠ESCs中的多梳抑制复合物2（PRC2）相关蛋白。ESCs中Pcl2的敲除导致自我更新特征增强、分化缺陷和组蛋白甲基化模式改变。整合全球基因表达和启动子占用分析，使我们能够确定PCL2和PRC2转录靶点并起草调控网络。我们描述了PCL2在调节未分化ESC中ESC自我更新基因的转录以及早期承诺和分化期间的发育调节器中的作用。

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数字

图1
图1。下调第2页导致自我更新能力增强和分化能力受损
A）微阵列表达谱第2页OCT4的−LIF和+RA单层分化：eGFP R1 ESCs。B）PCL2有三种预测的亚型。C）的相对表达式第2页对照和shRNA敲除克隆中的mRNA。D）的相对表达式10月4日,纳米、和Sox2系统在三个不同的第2页shRNA敲除克隆与野生型R1和qPCR测定的两个错配对照进行比较。数据表示为三次试验的平均值±标准偏差。E&F）用定量免疫荧光法测定了三种不同细胞中10000个细胞的OCT4蛋白第2页shRNA敲除克隆在+LIF和-LIF条件下72小时以上。在E）OCT4表达的分布以一个代表性的直方图表示第2页shRNA敲除克隆和不匹配控制。分布最好建模为双高斯（红色曲线），它是OCT4负总体（绿色曲线）和OCT4正总体（蓝色曲线）的汇编。垂直红线表示OCT4+ve和−ve种群之间的阈值，报告高于和低于该阈值的细胞百分比。在F）报告了每个时间点失去OCT4表达的细胞百分比。误差条表示一式三份实验的标准偏差。G&H）三个不同的第2页将shRNA敲除克隆、野生型R1和两个错配对照细胞接种在+LIF中，通过形态学和碱性磷酸酶（ALP）表达测定未分化或完全分化的菌落在每个培养板上的分布。结果是三个单独实验的平均值，每个实验重复三次。一）荧光图像描述第2页EB分化后，shRNA敲除和错配对照细胞染色检测平滑肌肌动蛋白、巢蛋白、甲胎蛋白或OCT4。分化实验重复进行。J）在悬浮液中形成EB并培养25天（左图）。25天后，将其胰蛋白酶化，在+LIF中培养3天，并对其进行ALP染色（右图）。
图2
图2。PCL2的诱导表达部分拯救击倒表型
A）两个第2页含有强力霉素诱导物的shRNA克隆Pcl2-IRES-βgeo在培养基中加入强力霉素前和72小时后，对表达盒进行β-半乳糖苷酶染色。B）通过Western分析，在强力霉素诱导后，两个救援克隆中的PCL2蛋白增加。C）通过qPCR分析，第2页强力霉素诱导后转录物增加。D&E）将救援克隆置于+LIF或-LIF中，加入或不加入强力霉素，并通过形态学和碱性磷酸酶（ALP）表达测定未分化或完全分化的菌落在每个培养板上的分布。F）在加入或不加入强力霉素的+LIF和−LIF中，救援克隆72小时内失去OCT4表达的细胞百分比。G）在多西环素中长期培养救援克隆前后ESC特异性自我更新基因的相对转录水平。表达水平以野生型R1细胞中表达的百分比报告。
图3
图3。PCL2是一种PRC2相关蛋白
A）ESC核蛋白的凝胶过滤色谱表明PCL2、EED、EZH2在相同的组分中共同洗脱。B）免疫印迹分析表明，在IP后用PCL2特异性抗体检测到EZH2和SUZ12蛋白。此外，PCL2蛋白在具有EZH2抗体的IP之后存在。C）亲和纯化SUZ12复合物的考马斯蓝染色凝胶。D）质谱结果显示PCL2与Suz12-HF的相互作用。
图4
图4。PCL2敲除在分化过程中干扰3meH3K27
A）免疫印迹分析显示OCT4、EZH2和3meH3K27在第2页shRNA敲除和错配控制细胞。α-微管蛋白作为负载对照。B）对照组与敲除组的H3K27单甲基化水平。C&D）EZH2型(C类)和3me-H3K27(D类)在LIF条件下，在6天内对10000个单个细胞中的蛋白质进行了测量。分布最好建模为多峰高斯（红色曲线），即低总体（绿色曲线）、中等总体（蓝色曲线）和高总体（黄色曲线）的组合。
图5
图5。PCL2靶点的全基因组评估
A）之间差异表达基因的火山图第2页shRNA敲除细胞和+LIF培养的不匹配对照细胞。垂直红线表示±1.5的折叠变化。微阵列一式三份，水平红线代表0.05的截止p值。B和C)敲除细胞中上调和下调基因的GO分析。D）由ChIP-seq确定的PCL2结合的富集DNA序列的位置。E）说明富集序列相对于已知TSS分布的直方图。F）GO分析表明，在ChIP-seq实验中富集的基因中，生物功能GO术语过度表达。通过将输入基因列表中GO术语的发生率（观察到的，红色条）与MGI数据库中记录的整个小鼠基因组中该GO术语的发生率（预期的，黄色条）进行比较来确定统计上过度表达的GO术语。Fisher精确检验用于确定每个术语的p值。
图6
图6。PCL2结合PRC2靶点子集并与3meH3K27相关
A）14个PCL2和PRC2靶的结合剖面。每个面板中的基因组范围从TSS到基因末端的-10kb。B-F）对PCL2、EZH2、EED、SUZ12和3meH3K27野生型和敲除细胞中的14个选定启动子区域进行ChIP-qPCR验证。数值计算为无抗体对照组上的倍增浓度。将野生型和敲除型样本归一化为每个测试引物集的输入材料的一部分，以调整起始量的差异。
图7
图7。预测依赖PCL2的调控网络
A）识别一个调节ESC多能性和自我更新功能的网络基序。由箭头连接的基因被启动基因激活，而由T-bar连接的基因受到抑制。启动子占用研究或敲除后的微阵列表达变化支持激活和抑制。B）PCL2-PRC2复合物靶向的发育基因类别概述。C）针对第2页抄本被用来猛烈抨击第2页细胞在首次转染48小时后再次转染，以维持第2页.的相对表达式第2页以及在转染后24和72小时在+LIF和−LIF中测量一组潜在靶点。D类)第2页在多西环素诱导72小时后，在救援克隆中诱导表达，并测量潜在靶点的转录水平。转录水平是相对于野生型ESCs中的表达水平报告的。E）微阵列结果来自第2页击倒和苏西12和鄂尔多斯2空单元格。
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    1. Beissbarth T，速度TP。GOstat：在一组基因中发现统计学上过度表达的基因本体论。生物信息学（英国牛津）2004；20:1464–1465.-公共医学
    1. Bernstein BE、Mikkelsen TS、Xie X、Kamal M、Huebert DJ、Cuff J、Fry B、Meissner A、Wernig M、Plath K等。二价染色质结构标志着胚胎干细胞中的关键发育基因。单元格。2006;125:315–326。-公共医学
    1. Boyer LA、Plath K、Zeitlinger J、Brambrink T、Medeiros LA、Lee TI、Levine SS、Wernig M、Tajonar A、Ray MK等。多梳复合物抑制小鼠胚胎干细胞中的发育调节因子。自然。2006;441:349–353.-公共医学

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