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.2010年4月1日；48(7):905-14.
doi:10.1016/j.freeradbiomed.2010.01.015。 Epub 2010年1月20日。

内皮细胞线粒体储备能力：一氧化氮和活性氧的影响

布莱恩·德兰卡 1, 布拉德福德·G·希尔, 维克多·M·达利-美国
附属公司

内皮细胞线粒体储备能力：一氧化氮和活性氧的影响

布莱恩·德兰卡等。 自由基生物医学. .

摘要

内皮细胞不被认为是一个主要的能量需要器官，但内皮细胞具有广泛的线粒体网络。这表明线粒体功能在应对这些细胞的应激和信号传递方面可能很重要。在本研究中，我们使用细胞外流量分析来测量粘附的牛主动脉内皮细胞（BAEC）的线粒体功能。在基础条件下，BAEC仅使用其最大呼吸容量的大约35%。我们计算得出，这代表状态3和状态4之间的中间呼吸状态，我们将其定义为状态（表观）等于3.64。有趣的是，这些细胞的表观呼吸控制率（线粒体最大耗氧量/非ADP相关呼吸）约为23，大大高于分离线粒体经常获得的呼吸控制率。这些结果表明，内皮细胞中的线粒体高度耦合，具有相当大的生物能量储备。由于内皮细胞在血管疾病过程中同时暴露于活性氧（ROS）和活性氮物种，我们假设这种储备能力在应对氧化应激方面很重要。为了测试这一点，我们将BAEC单独或联合暴露于NO或ROS。我们发现，暴露于无毒浓度的NO或2，3-二甲氧基-1，4-萘醌（DMNQ）产生的低水平过氧化氢对线粒体基本功能几乎没有影响，但这两种处理都可逆地降低了线粒体储备能力。然而，NO和DMNQ联合治疗导致不可逆的储备能力丧失，并与细胞死亡相关。这些数据与内皮细胞线粒体储备能力在氧化应激反应中的关键作用相一致。

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数字

图1
图1。用XF24分析仪测量BAEC的线粒体功能
在测量OCR和ECAR之前，将Seahorse Bioscience V7组织培养板接种BAEC（20000–60000个细胞/孔），并允许其生长24小时。A组：基础OCR和ECAR测量三次，并绘制成细胞播种数的函数。B组表示在基础条件下测量40000个细胞的OCR的时间进程，随后依次添加寡霉素（1µg/ml）、FCCP（1μM）和抗霉素A（10µM），并测量OCR和ECAR，如图所示。对该进程曲线进行了注释，以显示非呼吸链耗氧量、ATP相关耗氧量的相对贡献、添加FCCP后的最大OCR以及细胞的储备容量。这些参数对细胞总耗氧量的贡献绘制在面板C中。所有数据均为平均值±sem，每组n≥3。*，与对照组相比p<0.05；#，与最大OCR相比，p<0.05。
图2
图2。表观呼吸状态随细胞密度增加而增加
小组A：国家显然的以20000–600000个细胞/孔接种细胞进行计算。B组：以40000个细胞/孔接种细胞，测定基本RCR和最大RCR值。所示数据为平均值±sem，每组n≥3。*，与基础RCR相比p<0.05。
图3
图3。线粒体耗氧量抑制剂处理BAEC的生物能量谱
将BAEC接种于40000个细胞/孔，并用10µM抗霉素A、1µg/ml寡霉素、1¦µM鱼藤酮、10¦ΜM TTFA、1 mM氰化物或10¦¦Μ）M粘噻唑处理，测量OCR和ECAR。对OCR和ECAR产生的影响绘制为每种治疗的基线测量值的百分比。所示数据为每个治疗组的平均值±sem.n≥3。
图4
图4。急性一氧化氮治疗会降低储备能力，但对基线耗氧量没有影响
以40000个细胞/孔接种BAEC，并允许其生长24小时。在对OCR进行基本测量后，在不使用或使用DetaNONOate（0-500µM）处理细胞1小时。面板a：0、250和500µM DetaNONOate的代表性痕迹。然后依次用1µg/ml寡霉素、1µM FCCP和10µM抗霉素A处理所有细胞。图B：急性NO处理对线粒体基础功能的影响。将NO注射后的第三速率绘制为Deta NONOate浓度的函数。C组：FCCP刺激OCR的变化显示为与原始基线相比的百分比增加，并且是Deta NONOate浓度的函数。D组：在没有或存在500µM Deta NONOate的情况下绘制线粒体活性导致的耗氧量。所示数据是在FCCP注入后立即进行OCR测量期间测得的氧气浓度。E组：Deta NONOate处理细胞的线粒体储备能力。所示数据为平均值±sem，每组n≥3。
图5
图5。急性一氧化氮减少状态显然的增加细胞外酸化率
BAEC以40000个细胞/孔接种，并允许生长24小时。以指示浓度注射Deta NONOate，并允许细胞培养1小时显然的使用NO注射后的第三次注射速率作为基础速率进行计算。数据绘制为Deta NONOate浓度的函数（面板a）。测定每个治疗组的基础ECAR，并绘制为Deta NONOate浓度的函数（B组）。通过绘制每种Deta NONOate浓度的OCR与ECAR来确定对代谢谱的净影响（图C）。所示数据为平均值±sem，每组n≥3。*，与对照组相比，p<0.05。
图6
图6。急性DMNQ治疗降低最大OCR
BAEC以40000个细胞/孔的速度接种，并允许生长24小时。对OCR和ECAR进行三次基线测量，然后用DMNQ（15µM）处理细胞1小时。处理后，在依次注射寡霉素（1µg/ml）、FCCP（1µM）和抗霉素A（10µM）之前进行三次进一步测量测定线粒体功能（图A）。B组：测定了DMNQ引起的基础OCR增加，并绘制了DMNK浓度的函数图。面板C：计算了质子泄漏，并显示了对照细胞和DMNQ（15µM）处理细胞的质子泄漏。D组：DMNQ处理后的储备容量也绘制为DMNQ浓度的函数。面板E：根据所述计算表观呼吸状态，并显示对照组和DMNQ（15µM）处理的细胞。小组F：在一些治疗组中，向二苯亚碘铵（10µM）中添加DMNQ。显示DMNQ依赖的OCR刺激受到抑制。所示数据为平均值±sem，每组n≥3。*，除非另有说明，否则与对照组相比p<0.05。
图7
图7。Deta NONOate和DMNQ联合处理刺激质子泄漏
BAEC以40000个细胞/孔接种，并允许生长24小时。对OCR和ECAR进行三次基线测量，然后用Deta NONOate（250µM）和DMNQ（15µM，和抗霉素A（10µM）测定线粒体功能。B组：质子泄漏计算为寡霉素不敏感OCR减去抗霉素A不敏感OCR。还测定了非线粒体或抗霉素A不敏感的OCR（C组）。D组：使用500µM Deta NONOate处理的细胞和指定浓度的DMNQ作为辅助处理，采用MTT法测定细胞活力。细胞活力以对照处理细胞的百分比计算。所示数据为平均值±sem，每组n≥3。*，与对照组相比p<0.05。#，与仅匹配浓度DMNQ对照组相比，p<0.05。
图8
图8。去除Deta NONOate或DMNQ后可逆转OCR抑制，但这些治疗不能联合使用
BAEC以40000个细胞/孔接种，并允许生长24小时。对OCR进行三次基线测量，然后用Deta NONOate（250µM）、DMNQ（15µM。将平板从XF24中取出，并将指定组的培养基更换为新鲜的分析培养基。然后在依次注射寡霉素（1µg/ml）、FCCP（1μM）和抗霉素A（10µM）之前，进一步测量基础OCR，以确定线粒体功能。实验的这一部分如图A所示。图B：计算了存在Deta NONOate或去除NO供体的细胞的储备容量。C组：计算存在DMNQ或移除DMNQ时细胞的储备容量。图D：在Deta NONOate和DMNQ联合存在或去除这些化合物的情况下，计算细胞的储备容量。所示数据为平均值±sem，每组n=5。*，与对照组相比，p<0.05。§，与清洗对照组相比，p<0.05。
图9
图9。Deta NONOate慢性治疗可降低基础OCR
BAEC以40000个细胞/孔（面板A）或20000个细胞/井（面板B）接种，并允许其生长24小时。然后在指定的时间内用指定浓度的Deta NONOate处理细胞。然后按所述测量基础OCR。C组：在6孔板中生长的BAEC用指定浓度的Deta NONOate处理16小时。通过SDS-PAGE和Western blotting对细胞进行裂解和收获以进行蛋白质分析。COX I和Vb的代表性印迹以及这些蛋白质的定量显示。所示数据为每组的平均值±sem.n≥3。*，与对照组相比，p<0.05。
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