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。2010年2月2日；107(5):1864-9.
doi:10.1073/pnas.0910603106。 Epub 2010年1月11日。

用于低剂量体内基因沉默的类脂质材料

凯文·T·洛夫 1, 克里·P·马洪, 克里斯托弗·莱文斯, 凯瑟琳·怀特黑德, 威廉·奎伯斯, J罗伯特·多金, 秦琼（June Qin）, 威廉·坎特利, 刘良琴, 蒂莫西·拉西, 玛丽亚·弗兰克·卡梅内茨基, 叶嘉宁, 雷内·阿尔瓦雷斯, 迪纳·W·Y·萨赫, 安东尼·德福格罗尔斯, 凯文·菲茨杰拉德, 维克托·科特利安斯基, Akin Akinc公司, 罗伯特·兰格, 丹尼尔·安德森
附属公司

用于低剂量体内基因沉默的类脂质材料

凯文·特洛夫等。 美国国家科学院程序。 。

勘误表in

  • 美国国家科学院院刊2010年5月25日；107(21):9915

摘要

为了发现和开发能够引导小干扰RNA（siRNA）穿过保护靶细胞内部的许多屏障的载体，人们付出了巨大的努力。虽然研究已经证明了体内基因沉默的潜力，但需要提高递送效率，才能发挥RNA干扰疗法的最广泛潜力。通过组合合成和筛选不同类别的材料，已经确定了一种配方，该配方能够在剂量低于0.01 mg/kg的情况下使小鼠体内的siRNA-directed liver gene沉默。该配方还表明，在一次注射后，该配方可特异性同时抑制五种肝脏基因的表达。该配方的潜力在非人类灵长类动物中得到了进一步验证，在低至0.03 mg/kg的剂量下，可以观察到临床相关基因转甲状腺素的高水平敲除。据我们所知，这种制剂有助于基因沉默，其剂量比任何先前描述的小干扰RNA肝脏递送系统所需的剂量低。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：赞助商声明存在利益冲突。R.L.是Alnyam科学咨询委员会的股东和成员。D.G.A.是Alnylam Pharmaceuticals的顾问。R.L和D.G.A赞助了Alnyam的研究拨款。阿尼勒姆还拥有安德森博士、兰格博士及其同事在麻省理工学院发明的某些知识产权的许可证。阿尼勒姆雇佣了W.Q.、J.R.D.、J.Q.、W.C.、L.L.Q.、T.R.、M.F.-K.、K.F.、V.K.、A.F.、R.A.、D.W.Y.S.和A.A。作者宣布存在利益冲突。R.L.是Alnyam科学咨询委员会的股东和成员。D.G.A.是Alnylam Pharmaceuticals的顾问。R.L和D.G.A赞助了Alnyam的研究拨款。阿尼勒姆还拥有安德森博士、兰格博士及其同事在麻省理工学院发明的某些知识产权的许可证。阿尼勒姆雇佣了W.Q.、J.R.D.、J.Q.、W.C.、L.L.Q.、T.R.、M.F.-K.、K.F.、V.K.和A.A。

数字

图1。
图1。
环氧衍生类脂化合物库的合成(A类)合成组合文库时使用了端环氧烷基链和含胺单体(B类)通过高效开环将环氧化合物添加到胺中可以实现库成员的并行合成
图2。
图2。
类脂化合物库的体外筛选。在荧光素酶表达的Hela衍生细胞系中筛选类脂化合物。(A类)抗萤火虫荧光素酶siRNA与类脂化合物复合，并在生长介质中与细胞孵育。通过比较治疗组和未治疗对照组中检测到的蛋白水平来确定萤火虫荧光素酶的相对表达。(B类)低剂量siRNA（s.d。，n个 = 4)
图3。
图3。
在小鼠体内沉默因子VII。A类)纯化来自体外筛选的表现最好的类脂，配制用于血清稳定性，并静脉注射给C57BL/6小鼠。小鼠通过尾静脉注射单次注射3 mg/kg总siRNA，并在注射后72 h对因子VII水平进行量化。B类–天)体内筛选的前三类脂质的剂量反应实验；C16-96号(B类)，C14-110(C类)和C12-200(天). 通过体重损失测量，未观察到脂质相关毒性(电子). （日期：。，n个=3或4*P（P） < 0.005, **P（P） < 0.001; t检验，单尾）
图4。
图4。
通过监测因子VII蛋白水平超过40天来研究C12-200介导的沉默在体内的持续性。我们给小鼠单次注射1或0.1 mg/kg siRNA，并在不同的时间点采集血样，以定量血清蛋白水平。（日期：。，n个=3）
图5。
图5。
用C12-200配制的混合siRNAs单次注射可同时沉默五个肝细胞基因靶点。我们给小鼠注射了单剂量，剂量分别为0.2和.005 mg/kg/siRNA。注射后72小时，采集肝组织以分析基因转录水平。（日期：。，n个 = 5).
图6。
图6。
C12-200-siRNA颗粒通过大胞饮作用诱导细胞摄取。(A类)用C12-200配制的荧光标记siRNA与HeLa细胞在存在各种内吞途径标记的情况下孵育。含有siRNA的颗粒与标记的葡聚糖共定位，葡聚糖是一种已知通过大胞饮作用进入细胞的液相标记物(白色箭头）。(B类)肌动蛋白纤维的荧光标记显示膜皱褶(白色箭头所示）和肌动蛋白重排，这是HeLa细胞暴露于C12-200-siRNA颗粒后15分钟内通过大胞饮作用摄取的标志性指标。(C类,天)细胞预先暴露于EIPA和细胞分裂素D（分别为大胞饮作用抑制剂和肌动蛋白聚合抑制剂）会以剂量依赖的方式减少C12-200-siRNA颗粒的摄取。（日期：。，n个 = 3, ***P（P） < 0.005; **P（P） < 0.01; *P（P） < 0.05
图7。
图7。
C12-200对非人灵长类动物的疗效。食蟹猴(n个=3/组）接受PBS或0.03、0.1或0.3 mg/kg siTTR，在C12-200中配制，通过头静脉静脉输注15分钟（5 mL/kg）。给药后48小时从动物身上采集肝脏活检。TTR公司mRNA水平与GAPDH公司测定肝脏样品中的mRNA水平。数据点代表组平均值±s。d日
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