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.2010年1月19日；107（3）：1112-7。
doi:10.1073/pnas.0908486107。 Epub 2009年12月28日。

Polycomb组蛋白EED将TNF受体1与中性鞘磷脂酶偶联

斯蒂芬·菲利普 1, 麦芽Puchert, 萨宾·阿达姆·克拉奇, 弗拉基米尔·奇科夫, Supandi Winoto-Morbach公司, 萨宾·马修, 安德烈亚·迪尔伯格, 尤米拉·科尔克, 诺玛·马切西尼, 迪特尔·卡布利茨, 优素福·A·汉农, 斯特凡·舒茨, 迪特尔·亚当
附属公司

Polycomb组蛋白EED将TNF受体1与中性鞘磷脂酶偶联

斯蒂芬·菲利普等。 美国国家科学院程序. .

摘要

磷脂酶中性鞘磷脂酶（N-SMase）被认为是炎症、细胞发育和生长、分化和死亡等过程的主要介质，也被认为是阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、心力衰竭、缺血/再灌注损伤或垂体激素联合缺乏症等疾病的主要介质。虽然近二十年前就有人描述过前炎症细胞因子TNF激活N-SMase，但其潜在的信号通路尚未解决。在这里，我们确定Polycomb组蛋白EED（胚胎外胚层发育）是nSMase2的相互作用伙伴。在酵母中，EED的N末端与nSMase2的催化结构域以及RACK1结合，RACK1是一种通过TNF与TNF受体1（TNF-R1）相关蛋白FAN协同调节nSMase 2活化的蛋白质。在哺乳动物细胞中，TNF导致内源性EED从细胞核移位，并与内源性nSMase2和RACK1共定位和物理相互作用。因此，EED和nSMase2被招募到TNF-R1.FAN。RACK1-在激活nSMase2的同时，在一个时间段内完成。通过RNA干扰击倒EED后，nSMase2的TNF-依赖性激活被完全消除，EED被确定为一种蛋白质，它在物理和功能上都将TNF-R1与nSMase1偶联，因此它代表了完成TNF-R1最后一条未解决的信号通路之一的“缺失环节”。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
nSMase2、EED和RACK1相互作用域的映射。所用nSMase2的示意图(A类)、EED(B类)、和机架1(C类)构造。每个结构体编码的氨基酸范围在其名称下方给出。(D类)nSMase2、EED和RACK1的交互域概述。此外，还显示了RACK1的最小核心绑定域以及FAN的交互域（14）。海滩、米色和Chédiak-Higashi域；IH，膜内疏水结构域；PH，pleckstrin-homology域。WD重复用罗马数字标记。
图2。
图2。
过度表达的EED和nSMase2在哺乳动物细胞中共定位和共免疫沉淀。(A类)转染pMYC.nSMase21–655(左侧，红色)或pFLAG。EED公司2–441(赖特，红色)在293个细胞中检测到。(B类)在转染pFLAG之前，用TNF处理Jurkat细胞指定的时间。EED公司2–441检测到(绿色)。(C类)用pFLAG转染Jurkat细胞。EED公司2–441(红色)和pMYC.nSMase21–655(绿色)用TNF刺激指定时间。EED和nSMase2的着色通过黄色染色（覆盖）表示。细胞核用DAPI染色(蓝色)。（比例尺，10μm）(D类)myc标记全长nSMase2的免疫沉淀(左侧)或nSMase2CD(赖特)和转染293细胞的载体对照。(E类)显示全长nSMase2反向关联的平行实验(左侧)和nSMase2CD(赖特)带EED。对于两者(D类)和(E类)显示，共免疫沉淀FLAG-EED、myc-nSMase2或myc-nSMase2CD(顶部，星号)；(中部和底部)融合蛋白在总裂解物中的表达。
图3。
图3。
内源性EED、nSMase2和RACK1蛋白的相互作用。(A类)Jurkat细胞用TNF处理指定时间，然后检测内源性EED蛋白(绿色)。(B类)对Jurkat细胞进行TNF诱导的内源性EED共定位分析(绿色)和nSMase2(红色)。(C类)用TNF刺激或不刺激Jurkat细胞3min后，Western blot检测细胞胞质、膜和核组分的内源性EED。多条带代表先前描述的内源性EED的不同亚型（25）。肌动蛋白、微管蛋白、泛粘连蛋白和组蛋白的检测证实了等负荷和成功分馏。(D类)内源性EED与内源性nSMase2的协同免疫沉淀(左侧)反之亦然(赖特)来自Jurkat(上部)或HeLa细胞(下部)。用TNF处理3min或不处理3min的细胞免疫沉淀nSMase2或EED，共免疫沉淀内源性EED(星号)Western blot检测nSMase2。293个过度表达pFLAG细胞的裂解物。EED公司2–441或pMYC.nSMase21–655（略高于内源性nSMase2迁移）用于控制。描述免疫沉淀nSMase2或EED的斑点显示在相应的联合免疫沉淀下面。(E类)p标记。EED公司2–441和pMYC.nSMase2318–655（nSMase2CD）在293细胞中过度表达，然后用TNF处理0和10分钟。随后，用免疫沉淀法检测FLAG-EED，并用Western blot检测共免疫沉淀myc-nSMase2D(左上)。左下角显示免疫沉淀FLAG-EED蛋白作为对照。检测未处理细胞和TNF处理细胞的总裂解物，以检测myc-nSMase2CD、FLAG-EED和肌动蛋白的相等表达，并将其作为负荷对照(赖特)。(F类)Jurkat细胞的免疫沉淀物如图所示(D类)重新分析共免疫沉淀内源性RACK1的存在(箭头)。作为对照，显示了293个细胞裂解物中丰富的内源性RACK1。(G公司)对Jurkat细胞进行TNF诱导的内源性EED共定位分析(绿色)和机架1(红色)。细胞核用DAPI染色(蓝色)。（比例尺，10μm）
图4。
图4。
TNF-R1复合物中EED和nSMase2的TNF-依赖性招募。(A类)含有标记的TNF•TNF-R1-复合物的磁性组分是在用TNF刺激Jurkat或HeLa细胞指定时间后获得的，并通过免疫印迹检测内源性TNF-R1、RACK1、EED和nSMase2的存在/募集。蛋白细胞提取物用作对照（裂解物）。(B类)RACK1、EED和nSMase2与磁性TNF-R1的共免疫沉淀。将从未经处理或经TNF处理的Jurkat细胞分离的TNF受体磁性部分溶解，使用生物素-TNF/链霉亲和素包裹的磁性微球沉淀TNF-R1，并分析共免疫沉淀RACK1、EED和nSMase2。
图5。
图5。
TNF激活nSMase2需要EED。(A类)对未转染的Jurkat细胞或用阴性对照siRNA或EED特异性siRNA进行核型转染的Jurkat细胞进行内源性EED表达分析。细胞核用DAPI染色(蓝色)。（比例尺，10μm）(B类)或者，在测量N-SMase活性之前，用TNF处理细胞指定的时间。所示值代表平行进行的三次测定的平均值；误差条表示各自的标准偏差。显示了两个具有类似结果的独立实验中的一个。
图6。
图6。
EED是将TNF-R1与nSMase2耦合的缺失环节。该方案描述了EED在N-SMase途径中的拟议作用。TNF-R1对TNF的反应激活导致EED从细胞核转移到质膜，在质膜上与RACK1结合，成为TNF-R1•FAN•RACK1复合物的一部分。同时，EED与nSMase2的催化C末端结构域结合，该结构域比紧密膜集成的N末端区域更容易接近。这种相互作用将nSMase2物理连接到TNF-R1•FAN•RACK1•EED复合体，从而激活nSMse2。随后，nSMase2被EED独立机制停用。nSMase2的膜拓扑结构，包括棕榈酰化簇（P）和两个N端疏水段（HS1，HS2）改编自参考文献。
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