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.2010年3月；30(5):1269-84.
doi:10.1128/MCB.01328-09。 Epub 2009年12月28日。

RAB26和RAB3D是MIST1的直接转录靶点，调节外分泌颗粒成熟

田晓林 1, 拉蒙·U·金, 安德鲁·布雷德梅耶, 爱德华·J·奥茨, Katarzyna M Błazewska公司, 查尔斯·麦肯纳, 杰森·米尔斯
附属公司

RAB26和RAB3D是MIST1的直接转录靶点，调节外分泌颗粒成熟

田晓林等。 分子细胞生物学. 2010年3月.

摘要

关于分化细胞如何重组其细胞结构以执行特殊生理功能，人们知之甚少。MIST1是一种进化上保守的转录因子，在胃酶原（主要）细胞（ZC）与黏液颈细胞祖细胞分化时，需要MIST1来形成大的、专门的分泌小泡。这里，我们显示MIST1与高度保守的CATATG E-box结合，直接激活6个基因的转录，包括编码小GTPase RAB26和RAB3D的基因。我们接下来显示，在Mist1（-）（/）（-）ZC中RAB26和RAB3D表达显著下调，这表明Mist1通过诱导RAB转录建立了大分泌颗粒。为了验证这一假设，我们用红色荧光蛋白（RFP）标记的胃蛋白酶原C（ZC的关键分泌产物）转染稳定表达MIST1的人胃癌细胞系。这些细胞上调RAB26和RAB3D的表达，形成大的分泌颗粒，而对照非MIST1表达细胞则没有。此外，MIST1表达细胞中的颗粒形成需要RAB活性，因为用RAB丙酰化抑制剂治疗和显性阴性RAB26转染可消除颗粒形成。总之，我们的数据建立了分子过程，通过该过程，转录因子可以通过增加特定细胞效应器的转录，直接诱导基本的细胞结构变化，这些效应器起到组织独特的亚细胞隔室的作用。

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数字

图1。
图1。
MIST1是发育和维持大的产酶分泌颗粒和顶端-基底方向所必需的。（A） 来自野生型和薄雾1−/−老鼠。注意细胞核的中心位置，以及成熟顶端分泌小泡的缩小薄雾1−/−ZC公司。SV，成熟分泌小泡；N、 细胞核。（B） 左侧面板显示野生型和薄雾1−/−胃单元底部的ZC（胃腔朝向左侧，底部朝向右侧）。免疫标记还显示了细胞和颗粒的取向，其中抗GIF（红色）标记颗粒，抗β-肌动蛋白（绿色）标记间充质细胞位于细胞底部和胃单位腔，抗E-钙粘蛋白（紫色）标记基底外侧细胞-细胞-细胞边界，双苯甲酰亚胺（蓝色）标记细胞核。白色虚线代表基底膜。右边的面板是荧光标记细胞的卡通。请注意薄雾1−/−ZCs的细胞核更靠近管腔，分泌颗粒更少，更位于基底。（C） 多个ZC的分泌囊泡区域通过TEM显微照片进行量化。对于所有数字，**表示P（P）值<0.01和***表示P（P）值<0.001。WT，野生型。（D） 在免疫标记实验（如B组所述）中，对来自多只小鼠的多个ZC进行细胞内顶端（腔到核）和基底（基到核）分泌颗粒免疫荧光定量。每个点是由单个ZC中的抗PGC（PGC是产酶颗粒的主要成分）确定的顶端与底部平均荧光强度的比值。请注意，野生型ZC主要有颗粒的顶端分布，而在薄雾1−/−ZCs公司。（E） 显示胃单位颈部粘液颈部细胞祖细胞产生ZCs的漫画。在没有MIST1的情况下，迁移到基底的ZC表现出根尖组织和颗粒形成/维持缺陷（另见参考文献50）。
图2。
图2。
在AGS和HGC-27胃细胞系中瞬时转染MIST1可增加一组常见基因的表达。（A） 维恩图显示，瞬时转染MIST1后，两种不同胃上皮细胞系（HGC-27和AGS）中Affymetrix HGU133_Plus_2基因芯片探针组的数量增加。（B） 18个探针组（16个基因）在基因芯片上的表达强度在两个细胞系中都比载体转染和未转染对照的表达强度增加。
图3。
图3。
MIST1过表达激活的几个基因具有进化上保守的第一内含子规范MIST1 E-box序列。（A） 所有MIST1型E盒（CATATG）均在图2中16个人类基因的第一个内含子和转录起始的5′中鉴定出来（参见材料和方法）。然后确定了相对于传说中列出的其他脊椎动物物种（通过物种名称的两个字母缩写识别的物种）的进化保护。基因（灰色条）按比例排列，外显子编号为蓝色，基因区域分析为黑色。请注意，位于这4个基因第一外显子末端1 kb范围内的CATATG序列具有显著的保守性（红色括号）。对每个保守内含子序列的引物进行MIST1结合分析（图4）；生成对照引物以评估MIST1与无CATATG区域的结合（用带方框C的箭头指示的扩增产物）。在某些情况下，还评估了MIST1与具有非服务CATATG序列的区域（由带方框M的箭头表示）的结合。（B和C）面板A中所示的两个受监资产基础MIST1转染诱导的基因，但每个CATATG有详细的序列比对。*，一致序列在给定物种的反平行链上运行。注意，保守内含子CATATG受监资产基础26在人类和黑猩猩中有一个单点突变，破坏了电子盒。这些物种的基因组在转录开始的上游有另一个MIST1结合位点～11.5kb；牛基因组同时具有内含子和5′位点。Gg、，五倍子; Hs、，智人; 点，黑猩猩; Rm，猕猴；马里兰州，短尾负鼠; 嗯，小家鼠; 雷诺数，褐家鼠; 囊性纤维变性，家犬; Bt、，Bos金牛.
图4。
图4。
保存的MIST1 E-box序列直接由MIST1绑定。代表≥3个独立ChIP实验的PCR扩增子的凝胶电泳图像，使用抗MIST1抗体，然后使用引物，引物指向保守内含子CATATG[MIST1位点（保守）]或图3中所示的非保守CATATG和对照区域。输入1:10，基因组DNA免疫沉淀前稀释1:10；免疫前，非特异性兔抗血清的免疫沉淀。所有从PCR中采集的图像都运行了35个周期，尽管每个反应体积都是在多个周期中采样的，以确保放大不会停滞。注意，保守的CATATG序列显示出比免疫前对照结合的DNA更强的MIST1结合的DNA扩增，并且在没有CATATG序列的对照位点没有检测到MIST1结合的DNA。未检测到的CATATG位点显示几乎没有可扩增的MIST1结合DNA。
图5：。
图5：。
R（右）AB公司三D类和R（右）AB公司26表达具有酶原细胞特异性和MIST1依赖性体内。的图像我n原位显示了小鼠胃底腺切片的杂交，显示了局限于腺体底部ZC的反义RAB3D（A）和RAB26（B）信号。注意壁细胞中没有信号（每个主面板下方高放大视图中的箭头）。（C） LCM分离的ZCs的定量RT-PCR结果薄雾1−/−老鼠。这些小鼠的RAB3D和RAB26表达水平显著降低。请注意年轴值表示为对数218S rRNA归一化后与不含cDNA的微孔中水平相关的值；因此，零表示给定放大器基本上没有可检测的电平。RAB26在薄雾1−/−老鼠几乎完全被废除了。另一个潜在MIST1靶点CCPG1的引物表明，表达没有显著变化（n.s.），表明MIST1的缺失特别影响两个RAB的水平。WT，野生型。
图6。
图6。
PGC-RFP转染后，HGC-MIST1细胞形成大的外分泌颗粒。（A） 稳定表达MIST1-eGFP（绿色核染色）的HGC-27细胞的荧光显微镜图像显示，用PGC-RFP转染后，对照细胞中没有形成大的PGC小泡（箭头）（仅稳定表达eGFP）。（B） 具有多个（≥3）大（≥1-μm）囊泡和弥漫性明亮囊泡的细胞在多个实验中被定量（注意，其余细胞显示高于背景RFP，但太暗而无法分类）。（C） HGC-MIST1和对照细胞ZC的TEM图像。注意（对照）HGC-27细胞中分泌囊泡的尺寸减小。SV，分泌囊。（D） TEM图像显示HGC-MIST1细胞中囊泡内容物（箭头）的胞吐。（E） 通过透射电镜对多个HGC-MIST1细胞和对照细胞的囊泡大小进行量化。
图7。
图7。
HGC-MIST1细胞中的大PGC-RFP囊泡依赖于RAB功能。（A） 来自6个分离培养的稳定HGC-MIST1细胞的qRT-PCR显示，相对于稳定表达eGFP的细胞，MIST1-e表达细胞中RAB26和RAB3D的表达显著增加，而非MIST1-eGFP。（B） 荧光显微镜图像显示短暂转染HGC-MIST1细胞后的PGC-RFP（红色）囊泡。（C） 经5 mM RAB抑制剂3-PEHPC处理的HGC-MIST1细胞中PGC-RFP囊泡的分散。（D） 转染RAB26T77N（显性阴性RAB26结构）的HGC-MIST1细胞中囊泡的分散。（E） 量化RAB功能抑制对具有大PGC小泡的细胞比例的影响。(P（P）这些值通过单因素方差分析（ANOVA）检验和Dunnett的多重比较校正确定。）eGFP-Ctrl，稳定表达eGFP-的对照细胞。（F） 通过量化每个细胞中的绿色（RAB26T77N）荧光强度来评估显性负RAB26转染对PGC-RFP囊泡形成的影响，并与同一细胞中的红色（PGC-RFF）荧光分布相关。“大囊泡”细胞是指具有多个（≥3）大（≥1-μm）囊泡的细胞；“小囊泡”细胞是指那些具有大量红色荧光的细胞（见材料和方法），而这些红色荧光并不分布在大囊泡中。大空泡表型几乎只发生在显性阴性RAB26表达有限的细胞中；只有5.16%的细胞在背景减影后的16位图像中的绿色MFI≥300（蓝线）。相反，与RAB26T77N共转染的有效细胞（MFI，≥300）中有64.4%的细胞具有弥散或小泡表型，表明这些细胞没有形成大的分泌小泡（红线）。（G） 瞬时转染的eGFP对PGC-RFP囊泡形成的影响最小，表明抑制大的PGC颗粒是RAB26而非细胞质GFP的作用所特有的。（H） 在用meGFP-RAB26T77N或eGFP瞬时转染后，具有小（扩散）或大PGC-RFP囊泡表型的HGC-MIST1细胞中背景以上的平均绿色像素强度的图示。注意，大囊细胞几乎没有meGFP-RAB26T77N表达。eGFP单独表达与PGC囊泡表型之间没有相关性。
图8。
图8。
说明当粘液颈部细胞分化为产酶细胞时如何诱导MIST1表达的示意图。MIST1被建模为主要通过RAB3D和RAB26发挥作用，以调节大的酶原颗粒，尽管其他MIST1靶点在这一过程中的作用并不一定被排除。MIST1的其他靶点可能参与MIST1诱导的心尖基底细胞形状重组。根据早期的研究，细胞骨架适配器CD2AP在这一过程中发挥作用，但不是MIST1的靶点（5）。rER的扩张不受MIST1表达缺失的影响。
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