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.2010年1月；13(1):133-40.
doi:10.1038/nn.2467。 Epub 2009年12月20日。

一个适用于整个小鼠大脑的健壮、高通量Cre报告和表征系统

琳达·马迪森 1, 特蕾莎·茨温曼, 苏珊·M·桑金, Seung Wook哦, 哈蒂姆·A·扎里瓦拉, 洪谷, Lydia L Ng女士, 理查德·德·帕米特, 迈克尔·J·霍利茨, 艾伦·R·琼斯, 埃德·斯莱恩, 曾洪奎
附属公司

一个适用于整个小鼠大脑的健壮、高通量Cre报告和表征系统

琳达·马迪森等。 自然神经科学. 2010年1月.

摘要

Cre/lox系统广泛用于小鼠，以实现细胞型特异性基因表达。然而，在Cre控制下，仍然缺乏一个强大且普遍响应的基因表达系统。我们已经生成了一组Cre报告小鼠，它们具有不同光谱的荧光蛋白的强大、普遍表达。这些报告者强大的天然荧光能够直接显示标记神经元的精细树突结构和轴突投射，这在绘制神经元回路、成像和追踪体内特定细胞群方面非常有用。利用这些报告员和高通量原位杂交平台，我们系统地分析了几个Cre-driver系小鼠大脑中的Cre定向基因表达，包括针对皮层不同细胞类型的新Cre系。我们的表达数据显示在公共在线数据库中，以帮助研究人员评估各种Cre驱动系在细胞类型特异性基因操作中的效用。

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数字

图1
图1
Cre-reporter系列的生成。（a）将Cre报告盒插入内源性外显子1和2之间内含子的Rosa26位点的基因靶向策略示意图。右上面板显示了部分Southern blot屏幕，使用印地安三世消化的基因组DNA和图中所示的探针。在线补充图1显示了全长印迹。（b）插入Rosa26基因座的不同Cre报告基因构建体的构型。通过转染PhiC31表达质粒删除Ai9 ES克隆中的PGK-Neo标记，生成Ai14 ES克隆。（c）Rosa26-EYFP和新报告株在皮层的报告表达比较。所使用的Cre线显示在每个面板上方。比例尺，100μm。（d）EIIa-Core/Rosa-YFP、EIIa-Cre/Ai2和EIIa-Cre/Ai3小鼠EYFP ISH信号的量化，全脑切片作为AOI。相对光密度测量为IOD比率：IOD比率=IOD/总AOI面积。IOD=∑OD（p），这样单个表达对象像素的光密度就可以在AOI上求和。***p<0.001（n=3节/脑；学生t检验）。（e）用2组引物对提取的小脑总RNA定量RT-PCR检测EYFP第二部分-Cre/Rosa26-EYFP，第二部分-Cre/Ai2或第二部分-Cre/Ai3小鼠。ΔCp=Cp YFP–CpGapdh公司.Cp，实时PCR循环数。Rosa-YFP，n=4；Ai2，n=8；Ai3，n=12；学生的t检验。***p<0.001。*p<0.05。绘制的值为平均值±SEM。
图2
图2
在新的报告行中显著增强了荧光标记。（a–b）与同一Cre驱动系交叉的不同报告系的荧光比较：个人2-（a）中的Cre，以及聊天-（b）中的Cre。IHC表明使用抗GFP进行免疫染色。与在轴突投射中也可见的td番茄荧光不同，ZsGreen荧光主要局限于细胞体。比例尺，500μm。（c）单神经元荧光定量第二部分-Cre/Rosa26 EYFP，第二部分-Cre/Ai2或个人2-Cre/Ai3小鼠，在暴露时间为140 ms（无饱和）的切片图像上。对三种类型的神经元进行量化，即小脑浦肯野细胞（cb，上面板）、皮层神经元（ctx，中面板）和海马CA1锥体神经元（hpc，下面板）。相对强度=对象（单元格）的强度–背景的强度。对于Ai2和Ai3中的每一个，n=30个神经元从每个区域的3个部分随机选择。对于Rosa-YFP，由于其他两个区域无法检测，因此在Purkinje细胞定量中仅使用了一个区域中随机选择的n=10个神经元。***p<0.001。绘制的值为平均值±SEM。（d–h）td番茄标记的不同细胞类型的不同形态：（d）齿状颗粒细胞；（e） 皮层中间神经元；（f） 浦肯野细胞；（g） 小脑Bergmann胶质细胞；（h） 树突棘。（i）大脑皮层第6层神经元的丘脑皮质投射Ntsr1号机组-Cre/Ai14小鼠。（j）将rAAV-Cre注射到体感皮层的Ai14小鼠的皮层丘脑投射。（k） 体内麻醉患者视皮层2/3层td番茄表达神经元（红色）和OGB负载神经元（绿色）的双光子成像Wfs1型-Tg2-CreERT2/Ai9鼠标。比例尺，50μm。
图3
图3
ISH特征数据的信息处理。（a）EYFP（绿色）与Slc6a3系列（红色）在Slc6a3系列-DFISH生产的Cre/Ai3鼠标。在VTA/黑质区域（左侧面板），EYFP主要与Slc6a3系列（>90%的细胞被联合标记），表明多巴胺神经元中预期的Cre重组。在前脑基底区（右图），EYFP阳性细胞簇Slc6a3系列-消极。比例尺，200μm。（b）EYFP ISH数据来自Slc6a3系列-Cre/Ai3小鼠被数字化并注册到艾伦参考地图集，允许进行解剖搜索和比较。注册的EYFP ISH数据的两个部分与解剖分区重叠。EYFP表达式出现在两个部分中（白色和红色箭头）。
图4
图4
新Cre系及其在不同皮层细胞类型中的差异重组模式。对于每个Cre系，报告基因的CISH（tdTomato（Tom）或EYFP）和报告基因的DFISH（绿色）加德1（红色）仅显示皮层。用于制造Cre系的一些内源性基因的CISH也显示在最右边的面板中。使用的小鼠有：（a） Wfs1型-Tg2-CreERT2/Ai9和Wfs1型-Tg3-CreERT2/Ai9与三苯氧胺诱导。（b） Scnn1a号-Tg2-Cre/Ai9和Scnn1a号-Tg3-Cre/Ai9。（c） Six3合金-Cre/Ai9。（d） A930038C07瑞克-Tg4-Cre/Ai9。（e） Ntsr1号机组-Cre/Ai3。（f） 8030451F13瑞克-Tg2-Cre/Ai9。（g） 凸轮2a-CreERT2/Ai14无或有三苯氧胺诱导。（h） 埃尔布4-2A-CreERT2/Ai14与三苯氧胺诱导，显示大脑皮层和海马区存在分散的中间神经元。的DFISH埃尔布4（绿色）和td番茄（红色）显示了在埃尔布4阳性细胞。DAPI染色显示为蓝色。比例尺，100μm。
图5
图5
两个紧密相关的敲入Cre系重组模式的比较，Pvalb公司-ires-Cre和Pvalb公司-2A-核心。(a–i)tdTomato报告者的CISH比较Pvalb公司-ires-Cre/Ai14小鼠（左侧面板：a、d、g），内源性Pvalb公司基因（中间面板：b、e、h）和td番茄报告基因Pvalb公司-2A-Cre/Ai14小鼠（右侧面板，c，f，i）位于大脑的3个区域：皮层（顶部面板：a，b，c）、海马（中部面板：d，e，f）和丘脑（底部面板：g，h，i）。(j–k)Pvalb-ires-Cre（j）和Pvalb-2A-Cre（k）之间td番茄（绿色）和Gad1（红色）的DFISH比较。(l–m（升-米）)Pvalb-ires-Cre（l）和Pvalb-2A-Cre（m）之间Pvalb（绿色）和tdTomato（红色）的DFISH比较。比例尺，200μm。
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